Western Blot（WB）实验方案

*本方案适用于细胞/组织样本，为一般通用方案，特殊样本请参考其他资料改进

简介

Western Blot（蛋白质印迹法，简称 WB）是分子生物学与生物化学领域的核心技术，也是蛋白质分析的金标准，它将 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白分离能力与免疫检测的特异性相结合，实现对复杂样品中特定靶蛋白的定性、半定量的表达分析，广泛应用于基础研究、临床诊断和生物技术开发等领域。

核心原理

通过SDS使蛋白质变性并赋予均匀负电荷，经 SDS-PAGE 按分子量大小分离蛋白；再通过电场将蛋白转移至硝酸纤维素膜或 PVDF 膜，利用靶蛋白特异性一抗结合，结合酶/荧光团偶联的二抗实现信号可视化；最终通过条带的存在、位置和亮度分析靶蛋白的表达与分子量。

实验流程

第一步：样品制备

提取细胞/组织中的蛋白并制备裂解液，全程样本、缓冲液置于冰上，防止蛋白降解。

通用所需材料

细胞培养物裂解液制备步骤

1. 按说明书制备裂解缓冲液，不含蛋白酶抑制剂时需补加，磷酸化蛋白检测加磷酸酶抑制剂；
2. 收集细胞
3. 贴壁细胞密度达到80-90%，可以用来提取蛋白。弃上清，用4℃预冷的PBS 清洗 2~3 次，加入裂解液（按照六孔板的每孔细胞加入150-250μL裂解液的比例加量），细胞刮刮下细胞，并用移液器吹打混匀，收集至EP管中，冰上裂解5min，也可用超声辅助裂解，10000-14000rpm，离心3-5min，取上清备用。
4. 悬浮细胞一般密度达到8–1.5 × 10⁶ 个/mL 时提取（通过细胞计数确认），经100–500 g 4℃离心5min，PBS 洗涤 2-3 次后重悬于预冷裂解液（1×10⁷个细胞加 1 mL 裂解液），冰上裂解5min，也可用超声辅助裂解，10000-14000rpm，离心3-5min，取上清备用。
5. BCA 法测定蛋白浓度，根据BCA测定的结果，用含蛋白酶抑制剂的裂解液把样本的蛋白浓度调齐。
6. 添加上样缓冲液（含还原剂）稀释至总蛋白浓度1–3 μg/μL；
7. 分装，-80℃冷冻保存备用。

组织裂解液制备步骤

1. 将组织剪切成细小的碎片。

2. 充分融解RIPA裂解液，之后混匀。取适当量的裂解液，使用前数分钟内加入PMSF（分子量：2 g/mol），使其最终浓度为1mM。

3. 按照每20mg组织加入150-250L裂解液的比例加量。

4. 用匀浆器匀浆，充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续实验

5. 后续蛋白浓度测定、稀释、保存步骤同细胞样本。

【注意】：RIPA裂解液的裂解产物经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散这些透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。像检测一些常见的转录因子，例如NF-kB、p53，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

第二步：上样与电泳

根据靶蛋白分子量选择凝胶和缓冲液系统，通过 SDS-PAGE 分离蛋白。

所需材料

凝胶 / 缓冲液系统选择

*除了常见体系，爱必信还有小分子蛋白(Tris-Tricine体系）、大分子蛋白（Tris-Acetate体系）、非变性电泳（blue native page体系）、磷酸化（Phos-Key系列）

操作步骤

1, 将蛋白样本金属浴95℃，加热5min，加热完毕后样本冷却至室温，瞬离收集蛋白至管底。
2. 安装凝胶至跑胶装置，正确放置预制胶，按照说明书配制电泳缓冲液，加缓冲液至浸没凝胶，可以静置观察是否漏液，缓慢向上拔出梳子。
【注意】：有些预制胶需要撕掉底部胶条，拔出梳子时，不要造成胶条弯曲

3. 用移液枪在胶孔中分别加入marker和样品，推荐细胞样本20-50ug，组织样本50-100ug，纯化蛋白 10–500 ng（避免过载，移液器吸头不触碰孔底，防止条带变形）；
4. 连接电极，根据靶蛋白大小优化电压 / 时间（蛋白越大，电压越高、时间越长），一般可150V恒压跑30-50min，观察溴酚蓝跑至底部即可停止。

第三步：转膜

将凝胶中的蛋白转移至膜上，支持半干转移和湿转移，核心要求：凝胶靠近负极，膜靠近正极。

通用所需材料

所需材料	货号	产品名称
转印膜	abs932	PVDF膜（0.45μm）
	abs931	PVDF膜（0.22μm）
	abs959	NC膜（0.22μm）
	abs960	NC膜（0.45μm）
转膜液	abs9286	快速转膜液（10×）
甲醇	/	/

转印膜的选择

转印膜有PVDF膜和NC膜两种，PVDF膜需要用甲醇先激活，NC膜不需要。分子量小于20kDa的选孔径0.2um的，大于20kDa的选0.45um。

项目	NC 膜	PVDF 膜
灵敏度	高	高
背景	低	相对 NC 膜会有荧光背景 （背景高可将封闭液浓度提高）
蛋白结合能力	相对较弱80-110ug/cm2	蛋白结合能力比 NC 膜强6倍 125-200ug/cm2
材质质地	干的 NC 膜比较脆 （半干转温度较高 NC 膜容易干，转膜结束后需要尽快放到封闭液中）	机械强度高
操作程序	缓冲液浸润，无需甲醇激活	提前用甲醇激活
检测方式	ECL 检测	可用 ECL 检测及考马斯亮蓝染色
适用范围	> 20kd，0.45μm < 20kd，0.2μm

 

1. 等待电泳的期间,我们可以准备下一步需要的转膜液和膜。10×转膜液与甲醇和水的配置比例为1:2:7。

【注意】：加的顺序是水-转膜液-甲醇，甲醇跟水不要直接接触,避免大量产热；

2. 电泳结束后，把胶拆出来。
3. 在组装三明治时，要注意蛋白的流动方向是从负极到正极,可以先将板夹的负极,一般也就是黑色的那一面放在底层,然后依次放上海绵、滤纸和胶，膜可以提前根据胶的大小,进行剪裁并做好标记
4. PVDF膜在使用前需要激活，用甲醇浸泡30到60秒（NC膜不用激活）
5. 将完成激活的膜覆盖到胶上（注意有些膜要区分正反面），夹取膜时注意要夹到边角，尽量减少镊子和膜的接触，用滚刷赶走气泡，确认胶与膜之间无气泡后，可以依次放上滤纸和海绵，扣紧板夹，三明治结构组装完成，装入转印盒。
6. 湿转要倒入转膜液，将转印盒至于冰浴环境中，湿转最稳妥，半干转节省时间（半干转无需额外加入转膜液，一般不需要冰浴）安装时要注意正负极连接，黑色是负极
7. 一般可以按照恒压70/100V，恒流200-250mA，1min 1kD，这个条件可以适用于大多数分子量的蛋白(具体参考说明书电流对应时间转膜）。

【注意】：通过预染色 Marker 和丽春红染色验证转膜效率，荧光显色法禁用丽春红 S 染色（易产生高背景荧光）。

第四步：封闭和抗体孵育

封闭膜上非特异性结合位点，通过一抗/二抗特异性结合靶蛋白。

通用所需材料

所需材料	货号	产品名称
封闭液	abs9915	Western Blot 快速封闭液
	abs9175	脱脂奶粉
	abs952	TBST(10×)
	abs9157	牛血清白蛋白
一抗	国产抗体王国——“全”，30000+抗体 12000+靶标
二抗	abs20040	Goat anti-Rabbit IgG-HRP Antibody（470+文献）
	abs20039	Goat anti-Mouse IgG-HRP Antibody（170+文献）
抗体稀释液	abs954	WB专用一抗二抗稀释液

 

核心封闭液选择

• BSA：成分单一、无磷 / 无生物素、背景干净，适用于磷酸化蛋白、生物素-链霉亲和素系统、AP 检测、定量 WB，无绝对禁忌（部分抗体背景略高）。
• 牛奶：成本极低、封闭力强、易配制，适用于常规总蛋白、高丰度靶标、HRP 检测（非生物素）、不适用于磷酸化 / 糖蛋白、生物素系统、AP 二抗。
• 商品化稀释液：使用方便、标准化、批间稳定、含抗体稳定剂，一般情况下兼容性较高。

封闭

1. 完成转膜后，将膜移入到平皿或者其他适合的容器中（可以不洗涤膜）。
2. 根据膜的大小，加入适量体积的 Western Blot 快速封闭液，需完全浸没覆盖膜，对于 5x 8cm 的膜推荐使用量 5-10ml。
3. 置于水平摇床上，室温条件下振荡孵育10min。
4. 取出封闭完成的膜，用洗涤液（TBST/PBST）冲洗蛋白膜 2-3 次，即可用于后续抗体孵育。

抗体孵育步骤（一抗 + 二抗）

5. 按照供应商的推荐比例稀释一抗并孵育膜，4℃过夜/ 室温1h，TBST 洗涤 3 次 ×5 min；
6. 按照供应商的推荐比例稀释二抗，覆盖膜后室温轻柔振摇孵育 1 小时；
7. TBST再次洗涤膜 3 次，每次5min。

第五步：信号检测

根据实验选择荧光显色法或化学发光法，化学发光法支持 CCD 成像（推荐）和 X 射线胶片成像（无 CCD 时用）。

通用所需材料

所需材料	货号	产品名称
ECL封闭液	abs920	ECL化学发光检测试剂盒
	abs9434	超敏型ECL化学发光检测试剂盒
	abs9435	极敏型ECL化学发光检测试剂盒

（以X光胶片为例）
1、根据膜的大小，按每10cm²膜混合0.5ml溶液 A和0.5ml溶液B混匀，配制成发光检测工作液。
2、用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，以去除膜上多余的液体。膜的蛋白面朝上，置于洁净保鲜膜（某些市售保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜）上。用吸管将配制的发光检测液转移到蛋白膜上，使其均匀覆盖，室温孵育2min。
3、用平头镊夹持蛋白膜，膜的下缘轻轻接触吸水纸，以去除膜上多余的液体。膜的蛋白面朝上，包裹于洁净保鲜膜内。轻轻赶出其间的气泡，固定在X片暗盒内。
4、在暗室中取一张X片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光30秒至1分钟。立即显影定影，根据其曝光强度，缩短或延长下一张X片的曝光时间。

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