阿尔茨海默病的“多面杀手”：五种Aβ寡聚体毒性解析与ADDL制备

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种病因不明、发病机制复杂的原发性脑部神经性疾病，是最为常见的痴呆类型之一。临床主要表现为进行性记忆力下降、认知功能障碍、行为异常和人格失常等。其典型的病理改变包括神经元丢失、β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque, SP)及tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFT)等^[1]。

AD的致病机制至今仍是科学难题，而“β淀粉样蛋白（Aβ）假说”始终是研究的核心。科学家发现，真正导致神经元损伤、记忆衰退的并非最终沉积的老年斑，而是Aβ的“中间态”——寡聚体。更重要的是，Aβ寡聚体是一个“多面杀手”，不同聚集形态具有不同毒性机制，在疾病进程中扮演不同角色^[2]。

一、谁是真正的“凶手”？不同寡聚体，各有分工

Aβ寡聚体并非单一物质，而是一个复杂的家族，主要包括以下几种关键“成员”：

1、二聚体——核心破坏者

※ 主要存在于老年斑，是斑块形成的基础结构之一。

※ 毒性强，可抑制神经元突触功能，促进tau蛋白异常磷酸化。

※ 在AD晚期含量最高，是导致认知严重衰退的主因。

2、三聚体——早期预警信号

※ 在AD早期就已出现，尤其在轻度认知障碍期达到高峰。

※ 毒性相对较弱，但长期存在可启动病理进程。

3、Aβ*56——启动调控因子

※ 在临床症状出现前就已累积，是早期诊断的潜在标志物。

※ 与tau蛋白异常磷酸化高度相关，可能在AD启动阶段起关键作用。

4、Aβ来源的可溶性配体（ADDL）——高扩散性杀手

※ 毒性极强，扩散速度快，可迅速影响全脑。

※ 直接破坏突触结构，导致记忆相关蛋白丢失。

※ ADDL结合受体激活Fyn激酶，引发tau蛋白过度磷酸化及树突棘错位，形成“ADDL–Fyn–tau”毒性通路。

5、球聚体与环状原纤维（APFs）——结构破坏者

※ 主要出现在疾病后期，与老年斑形成密切相关。

※ 可干扰钙离子通道功能，影响神经信号传递；或嵌入细胞膜形成孔道，破坏细胞结构。

疾病进展图：不同寡聚体如何“接力作案”

二、如何研究特定寡聚体？以ADDL标准化制备为例

ADDL 被认为是一种可以在体外组装的 Aβ十二聚体，用原子力显微镜检测，发现它是一种5～6 nm 的球形颗粒^[3]。

市售Aβ多肽通常是混合聚集态，无法直接用于研究。为此，科学家开发了ADDL标准化制备流程，主要包括两步：单体化和ADDL制备^[4]。

1、HFIP 介导的单体化及 Aβ 肽的储存

（1）Aβ_1-42多肽以固体形式储存于-80℃。当准备制备多肽薄膜时，取出并置于冰上。

（2）将1,1,1,3,3,3-六氟-2-bing醇（HFIP，abs42044322）置于冰上，置于罩内并冷却。向固体Aβ_1-42多肽（abs45128173）中加入足量HFIP ，使最终多肽浓度为1 mM （例如，向1 mg Aβ_1-42中加入222 μL 冷 HFIP）。彻底冲洗小瓶。注意：HFIP 具有高度腐蚀性和挥发性。

（3）室温孵育至少1小时，保持瓶口密闭。溶液应澄清无色。若出现黄色痕迹或混浊悬液，则表明肽质量不佳，不得使用。

（4）将肽- HFIP 溶液放回冰上5-10分钟。

（5）将溶液分装至非硅化微量离心管中（例如，111 μL=0.5 mg，分装2管），不要封闭离心管。

（6）在室温下，使 HFIP 在通风橱中蒸发过夜。

（7）将试管转移至速冻真空干燥机中干燥10分钟。必须清除所有 HFIP 痕迹。所得肽应在试管底部形成一层薄而透明的膜，肽不应为白色或块状。

(8) 将干燥的肽膜置于干燥剂中于−80°C保存。该储备液应可稳定保存数月。

2、ADDL 制备

（1）将肽膜从-80℃冷冻箱中取出并置于冰上。

（2）将肽膜用新鲜无水DMSO（abs9185）重悬，配制成5 mM母液（向0.5 mg肽中加入22.2 μL DMSO）。彻底吹打移液管，冲洗管壁以确保肽膜完全重悬。DMSO母液应澄清无色。注意：DMSO吸湿性极强，务必使用新鲜开封的无水DMSO。

（3）取适量母液，迅速加入到预冷的不含血清和酚红的培养基（如Ham‘s F-12）中，使终浓度不超过100 μM（例如，取20 μL 5 mM母液加入980 μL Ham‘s F-12培养基）。立即盖紧管盖，在涡旋振荡器上以最大速度剧烈涡旋30秒。注意：5 mM肽原液应新鲜配制，不要将肽以DMSO原液形式储存，否则会形成原纤维！

（4）将溶液在4-8℃下孵育老化48小时。然后在冷冻离心机4℃以14000g离心10分钟；可溶性低聚物在上清液中，将上清液稀释10-200倍用于后续实验。注意：老化后由于在溶液中聚集形态不稳定，建议现配现用。

三、未来方向：从“清除Aβ”到“精准调控”

过去许多靶向Aβ的药物失败，原因可能是未能区分不同寡聚体的作用。未来研究应更注重：

（1）开发寡聚体特异性检测技术，实现早期精准诊断。

（2）阐明不同寡聚体间的转换机制，寻找调控关键点。

（3）研发针对特定寡聚体的药物，例如阻断ADDL扩散或抑制球聚体对钙通道的影响。

Aβ寡聚体不是单一靶点，而是一个动态演变的“毒性网络”。理解其不同“亚型”的角色与机制，将为我们提供更精准的诊断工具和治疗策略，为战胜阿尔茨海默病带来新希望。

参考文献：

[1] Puzzo D, Gulisano W, Palmeri A, et al. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery[J]. Expert opinion on drugdiscovery, 2015, 10(7):703-711.
[2] 安鹏远,王钦文,徐淑君.不同聚集状态的Aβ寡聚体在阿尔茨海默病发生中的作用机制研究进展[J].生物化学与生物物理进展, 2016, 43(2):6.
[3] Hillen H, Barghorn S, Striebinger A, et al. Generation andtherapeutic efficacy of highly oligomer-specific beta-amyloid J Neurosci, 2010, 30(31): 10369-10379.
[4] 吕君妍. Aβ1-42或Aβ1-15改善APP/PS1/Tau转基因阿尔茨海默症小鼠记忆的机制[D]. 华东师范大学, 2023.

AD造模相关产品推荐

Absin产品线：

爆款产品：十大试剂盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、生化检测、残留检测、多因子检测)；细胞培养(类器官试剂盒+基质胶，胎牛血清+培养添加剂+细胞因子)、分化试剂盒；分子(mRNA合成服务+提取试剂盒)；化合物大包装；辅助试剂、耗材/仪器、定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

特色产品：鸡胚提取物CEE、B27、N2、霍乱毒素B亚单位CTB、牛脑垂体提取物BPE、百日咳毒素PTX、重组人胰岛素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...

爱必信(上海)生物科技有限公司 联系邮箱：info@absin.cn 微信公众号：爱必信生物