基质胶在各实验领域中的应用_技术资料

品牌商

爱必信(上海)生物科技有限公司

入驻年限：12 年

联系人：
爱必信
所在地区：
上海
业务范围：
抗体、试剂、ELISA 试剂盒、细胞库 / 细胞培养、技术服务
经营模式：
生产厂商

在线沟通

电话

基质胶在各实验领域中的应用

234 人阅读发布时间：2022-12-23 15:16

一、基质胶介绍

基质胶是从小鼠肿瘤组织提取的基底膜成分（基底膜是动物体内上皮细胞基底面的一层基质膜），所形成的基质胶（图 1）。基质胶主要成分为层粘连蛋白，Ⅳ型胶原蛋白，巢蛋白。同时，基质胶也包含多种生长因子，例如表皮生长因子 EFG，血小板衍生生长因子 PDGF，神经生长因子 NGF，碱性成纤维细胞生长因子 FGF-2，乙型转化生长因子 TGF-beta 和胰岛素样生长因子 ILGF（Vukicevic et al.1992）。

图 1 基底膜在小鼠肿瘤组织中的位置分布

二、基质胶在各实验领域中的应用

2.1 血管生成实验

血管生成 (Angiogenesis) 是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉新的毛细血管性血管的生长。血管生成参与了需对疾病的病理变化，无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤，一日生长直径超过 1-2 mm，都会有血管生成。这是由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子诱导血管生成。控制血管生成有利于多种疾病的治疗，从病理学角度研究疾病状态下的血管生成和消退规律，采取有效的血管治疗策略以及开展器官转移等研究均有十分重要的意义。其中小管形成实验是测量在体外血管生成一种快速的可量化的方法。以永生化 HUVEC 细胞系为例：

2.1.1 实验材料

序号	材料	参数
1	HUVEC 细胞	5X10⁴per well
2	基质胶	50μL per well
3	96 孔细胞培养板	1 张
4	培养基	200μL per well

2.2.2 实验步骤

1. 将完全培养基换成饥饿细胞用培养基：加入含 0.2% FBS，2 mM L-谷氨酰胺，1 mM 丙酮酸钠，100U/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素的 DMEM 培养基培养 24 小时。
2. 将 OrganoGel 基质胶均匀铺满 96 孔板底。注意：枪头需提前预冷半小时。尽量在冰上操作，避免基质胶过早固化，避免气泡产生。

图 2 基质胶融化流程

3. 将 96 孔板在细胞培养箱孵育 30 min，固化基质胶。
4. 消化 HUVEC 细胞，并计数。
5. 将 200µL 的 HUVEC 细胞悬液（含 5X104 个细胞）加于含基质胶的 96 孔板中。将 96 孔板放于培养箱。
6. 血管样网络结构将于 3 至 12 小时间形成。
7. 在血管网络形成最佳时间，小心去除培养基，并用加入含活细胞染料 1/1000 Calcein AM（绿色）的培养基进行染色，并用显微镜进行拍照记录。

图 3 人脐静脉内皮细胞 HUVEC OrganoGel 基质胶上均可形成血管网络

2.2 干细胞的研究

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞。)胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。但是胚胎干细胞容易分化，所以在接种前用基质胶包被培养皿，在一定程度上可以防止其出现意外分化。且一般情况下，细胞接种在预先用基质胶包被的培养基质上会更有利于细胞的生长。下面以大鼠胚胎神经干细胞为例，操作所需时间为2h。

2.2.1 实验材料

序号	材料	参数
1	大鼠
2	Neurobasal medium
3	B-27 添加剂	2%
4	FBS	5%
5	EGF	20ng/mL
6	bFGF	20ng/mL
7	penicillin	100U/mL
8	streptomycin	100 µg/mL
9	基质胶	60μL per well
10	24 孔细胞培养板	1 张

2.2.2 实验方法

1. 取孕期 12-15 天的大鼠胚胎，用眼科剪和眼科镊分离出大脑皮层于 4°C 预冷的 DMEM 培养基中。
2. 用吸管轻缓吹打，然后用 70µm 滤网过来，获得单细胞悬液，并进行细胞计数。
3. 离心（300 g，3 min），弃上清。将细胞（含 5X104 个细胞）与 OrganoGel 基质胶进行混合，然后将基质胶混合物滴加在 24 孔板中，每孔 50µl。
4. 将 24 孔板放于培养箱，大约 10 min 后，OrganoGel 基质胶将凝固。加入 1 mL 神经元分化培养基：Neurobasal medium，2% B27, 2 mM L-glutamine，5%FBS，20ng/mL EGF 和 20ng/mL，bFGF，100U/mL penicillin 和 100 µg/mL streptomycin。第二天开始，就能观察到有明显的神经轴突生长。
5. 在第 7 天可观察到大量的神经突（Neurite）长出。

图 4 大鼠神经干细胞在 OrganoGel 基质胶中培养 7 天，并由神经细胞标志物 Tuj1 的抗体（红色）和细胞核染料 DAPI（蓝色）染色成像（A）

2.3 代谢及毒理研究

药物毒理学研究的方法主要是动物实验，通过在实验动物产生的作用来外推给人。新药毒性研究主要包括：急性毒性研究、长期毒性研究、制剂毒性研究以及特殊毒性研究。实验的方法主要是分为体内试验和体外试验，其中体外试验利用游离器官、培养的细胞、细胞器以及利用微生物等手段进行毒性研究，传统的 2D 细胞培养无法构建一个立体的微环境，因此与体内细胞功能存在很大差异，三维培养采用特殊的方法和材料，使细胞在三维空间程立体方式生长，更接近于体内的生长模式，形成类似体内组织的微结构。3D 细胞的培养主要分为基于支架的 3D 细胞培养和无支架 3D 细胞培养。

2.3.1 基于支架的 3D 细胞培养

基于支架的 3D 细胞培养方法发展历史悠久，具有大量的文献支持。用于细胞培养支架的材料有琼脂糖、胶原蛋白、纤维连接蛋白、明胶、层粘连蛋白等。这些复合材料通过孔隙率、纤维、渗透性和机械稳定性模拟天然细胞外基质（ECM），能够良好地模拟体内环境中细胞与细胞间的相互作用以及细胞与细胞外基质间的相互作用，同时允许细胞在支架上聚集、增殖和迁移。目前常用的支架材料主要是基质胶和明胶。具体实验操作方法可参考 2.2.2 中操作流程。

图 5 基于支架的 3D 细胞培养方法的示意(图片来源于网络）

2.3.2 无支架 3D 细胞培养

无支架的 3D 细胞培养是一种简单、便于操作的细胞培养方法，不需要额外添加细胞支架，而是使用经细胞排斥材质处理的细胞培养器皿或使用悬滴、微流控等特殊系统开展细胞培养，阻止细胞在器皿表面的贴附，迫使其聚集成团形成细胞微球。通过这种方法得到的 3D 细胞模型具有完整的球体结构，可以自发形成细胞外基质，并良好地模拟体内环境下的氧和营养梯度。

图 6 无支架 3D 细胞培养方法的示意(图片来源于网络)

2.4 类器官体外 3D 培养的研究

类器官属于三维 (3D) 细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。类器官可以从成体干细胞（ASCs）、多能干细胞（PSCs）（即胚胎干细胞，或 ESCs），或诱导的 PSCs（iPSCs）中衍生。类器官培养系统主要包括基质胶、维持类器官生态所需因子和分化所需因子这几个主要元素。基质胶中含有胶原、巢蛋白和纤连蛋白等等，为类器官形成三维空间结构提供基质。维持类器官生态因子主要目的为促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡等。

图 7 类器官培养流程

常见类器官培养相关细胞因子

实验方法如下：

1. 将基质胶于 4°C 冰箱里的冰上过夜解冻。
2. 将 24 孔板放置于培养箱预热。
3. 用预冷的枪头将解冻的基质胶进行分装。
4. 准备病人或者动物组织（或者类器官）来源的，细胞总数为 1*105 的单细胞悬液。300 g 离心 5 min。
5. 取 50µL 的 OrganoGel 基质胶与离心所得的细胞进行混匀。
6. 取出预热的 24 孔板，立即将基质胶与细胞的混合物滴加在孔板里，立即将 24 孔板放入培养箱。
7. 约 10 min 后，基质胶凝固后，向孔板里加入 500µL 类器官培养基，放于培养箱进行培养。

图 8 人胆管类器官在 OrganoGel 基质胶（标准型）中的生长情况。人胆管类器官由细胞核染料 DAPI（蓝色），紧密连接蛋白抗体 anti-ZO1 和细胞骨架蛋白 F-actin 的染料 Alexa Fluor 647 Phalloidin 染色成像。

2.5 Transwell 细胞体外侵袭实验

Transwell 细胞体外侵袭实验应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响及一些抑制血管生成的新药研究。Transwell 实验原理就是将 transwell 小室放入培养板中，并将高营养液与低营养液用一层膜隔开，细胞放在低营养液中，而为了获更多的营养，细胞则会穿过这层膜，进入高营养液。细胞 transwell 实验，可作为一种非常简便的研究肿瘤细胞迁移、侵袭以及转移情况的方法。

图 9 transwell 实验原理图

实验方法如下：

1. 铺基质胶: 在 4℃ 条件下将基质胶用无血清的细胞培养基或 PBS 缓冲液按照 1:8 比例稀释 (其稀释比例需要摸索，选择一个细胞穿过适中的浓度即可)，取 100ul 均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃ 放置 0.5-1 h，使其聚合成凝胶。

注意:
(a) 将枪头沿小室内壁将基质胶轻轻打出，切忌戳到小室滤膜;
(b) 加入的基质胶的体积不可太大。把聚碳酸酯膜浸湿即可;
(c) 注意低温，枪头、小室等都应该 4℃ 预冷。

2. 细胞培养: 取对数生长期的待测细胞，并用 PBS 洗涤，接着用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度为 1-10*105/ml。

3. 接种细胞: 在 24 孔板下室一般加入 500-650uL 含 5%-10%FBS 或趋化因子的培养基，然后用镊子将 Transwell 小室置于 24 孔板内，取细胞悬液 100-200µL 加入上室，最后放入培养箱中培养 12-48 h(根据癌细胞的转移能力而定)。

注意:
(a) 尽量避免气泡的产生: 下层培养液和小室间常会有气泡产生，会影响下层培养液的趋化作用。因此一旦出现大气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板;
(b) 注意细胞一定要接种均匀，建议沿着壁缓慢加入。
(c) 时间点的选择除了要考虑到细胞的转移能力以外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视如某些药物会抑制细胞的增殖。

4. 细胞固定：取出小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭基质胶和上室内的细胞。取新的 24 孔板加入 4% 多聚甲醛 600µL，将小室放入后固定 20-30 min。

5. 细胞染色及计数：奔固定液，用 0.1-%0.2% 结晶紫染色 5-10 min， PBS 洗 3 遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。适当风千后，在高倍显微镜下选取 5 个视野观察细胞并计数。

2.6 小鼠成瘤实验

动物实验由于其更能模拟人类的生理和病理条件，在肿瘤研究中，最常规的动物实验就是裸鼠成瘤实验。由于大部分肿瘤研究使用的是人类细胞，所以由于异种排斥的存在，我们需要免疫缺陷型小鼠来作为移植瘤模型的载体，通过对该小鼠的注射肿瘤细胞，使其成瘤，观察流体的生长来判断其生物学变化。

实验方法如下：

1. 搜集用于注射小鼠的细胞 1*105 个，以 1:1 的体积与 OrganoGel 基质胶混合，为方便注射，建议每次注射总体积不低于 100µL。
2. 用脱毛器对小鼠注射部位皮肤进行脱毛，然后用酒精棉球进行消毒。
3. 用不带针头的 1 mL 注射器将细胞和胶的混合物吸入针头，再装上 16 g 的针头（针头内直径为 1.194 mm），将混合物注射到皮下，或者大腿肌肉（针对代谢特别旺盛的肿瘤细胞）。

注意:
（a）动物选择：一般选择 4-6 周龄 Nude 裸鼠, 需要提前到 SPF 环境中适应 1 周。
（b）接种部位与接种量：接种部位常为皮下, 静脉或原位; 细胞量一般是 5*106 个/200µl, 但是不同的细胞系的接种量略有差别。
（c）成瘤时间：皮下接种的细胞一般会在 1-2 周成瘤, 一般不会超过 1 个月; 尾静脉和腹腔接种的细胞一般也是 1 周左右, 需要密切观察动物的体重与状态进行判断。
（d）注射的时候一定要注意别打漏了或者打到肌肉里，这样出来的瘤体积一致性很差。一般采用进针以后针尖向上挑，打的体积不超过 200µl。

三、基质胶的应用前景

随着科学的进步，由于 2D 细胞体外培养的局限性，3D 细胞培养在临床研究中的应用越来越多，其中基质胶在体外 3D 培养中发挥着至关重要的作用，基质胶主要是模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，可以有效促进正常细胞、转染细胞、贴壁生长的上皮细胞等细胞的粘附和分化，包括神经细胞，肝细胞，动物上皮细朐及黑素瘤等。同时在类器官培养、类器官药物敏感实验以及 Transwell 细胞体外侵袭实验都发挥着重要的作用。近 20 年，基质胶被广泛的应用于细胞分化、血管形成和肿瘤生长有关的研究。建立了许多的细胞分化模型、血管生成和肿瘤恶性程度相关检测方法。当细胞分化后，可以将其移植回动物，替代病变或缺损的组织。未来基质胶在体新型类器官模型构建、体外肿瘤细胞生物学特性研究及其他细胞方面的应用也一定会越来越广泛。

资料格式：

基质胶在各实验领域中的应用.docx

查看详细文档

免疫共沉淀实验·基础篇

小爱手把手教学—3D 类器官培养及研究思路

更多实验内容

在线沟通

我的询价

询价列表