小爱手把手教学—3D 类器官培养及研究思路

（1）将组织放入含有特殊组织保存液 F 的组织取样瓶中放入冰盒 4℃，拍照并登记信息。
（2）取样瓶消毒，组织放入培养皿，结直肠癌类器官缓冲液 A 清洗三次后于培养皿中剪碎，大约 1 mm3 的组织块。
（3）癌组织用 organo 原代酶解液 C 消化，37℃ 震荡消化 10-20 min，（消化过程中随时观察消化情况）加入三倍体积 organo 原代酶终止液 E 终止消化。
（4）使用 100μm 孔径的筛网进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察，可以看到明显的组织块，将滤液收集后于 300 g 富集离心 3-5 min 后移去上清，重新重悬离心。
（5）去除上清，使用适量基质胶（abs9495）进行重悬 (24 孔板为例，每孔 30ul）之后进行铺板（4℃ 下操作）拍照追踪定位。
（6）将铺好的板子放入 37℃ 培养箱中 10-15 min 成胶，添加培养基 B（恢复室温）进行培养。

2、类器官传代培养

（1）移液器吸去培养基，添加 4℃ 类器官缓冲液 A 放置一分钟。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在 15 ml 离心管中，4℃ 静置 5 min。
（3）离心 5 min 弃去液体，添加适量类器官缓冲液 A 重悬移入 1.5 ml 离心管，300 g 离心 5 min 弃去液体或（添加适量消化液 D 作用 90-120S 终止，离心 5 min 弃去混合液）。
（4）类器官收集后，添加适量类器官冻存液 G，按 500 个/ml 密度冻存（或进行步骤 5）。
（5）类器官收集后，基质胶重悬，每孔 30μl 基质胶铺在 24 孔板中，放置培养箱中 10 min 添加 500μl 结直肠癌类器官培养基 B。

 

3、冻存

 

（1）在传代第二步，添加冻存液。
（2）500 个/ml 密度冻存，温度梯度降温-80 度，保存。

 

4、类器官复苏

 

（1）取 10 ml 于 15 ml 离心管中。
（2）从液氮罐中取出冻存的肿瘤类器官细胞，快速置于 37℃ 水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2 分钟内完全融解。
（4）将溶解后的类器官细胞快速转移至 15 ml 无菌离心管，使用移液管轻轻吹打 3 次，300 g 离心 3 分钟，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量结直肠癌类器官缓冲液 A 重悬移入 1.5 ml 离心管 300 g 离心 5 min。
（5）基质胶重悬，每孔 20μl 基质胶铺在 24 控板中，放置培养箱中 10 min 添加 500μl 结直肠癌类器官培养基 B。

 

5、鉴定

类器官的鉴定主要有形态学观察、基因分析、标志物检测、组织学染色这几种手段。

6、药敏

 

（1）药物准备阶段（药物种类、浓度）。
（2）在传代基础上接种到 96 孔板上，加药，牌照。在药物活性第 5 天检测细胞活性。

 

类器官药敏检测全流程
 

类器官研究相关技术及解决方案
 

1. 基因编辑技术在类器官研究中的应用

 

CRISPR-Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源 DNA。CRISPR-Cas9 基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定 DNA 修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。
 

2020 年 3 月 2 日，荷兰胡布勒支研究组在 Nature Cell Biology 杂志上发表文章 Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing，利用非同源依赖的 CRISR-Cas9 技术快速高效地对人源类器官进行基因敲入，作者们将该技术命名为 CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，为人源类器官的内源基因敲入提供了重要的工具平台。

 

文章通过使用 CRISPR-HOT 的遗传工具来研究肝细胞如何分裂和具有太多 DNA 的异常肝细胞如何出现。通过让癌基因 TP53 失去功能，他们发现异常肝细胞的非结构化分裂更为频繁，这可能有助于促进癌症产生。随后使用 CRISPR-HOT 将荧光标记插入人类类器官的 DNA 中，从而使得这些荧光标记附着在他们想要研究的特定基因上，建立了人肝脏导管类器官的报告基因品系，可以利用活体成像、切片染色等方式可视化观察内源表达的基因表达模式以及动态变化过程。
 

2. 类器官在研究疾病发生发展的机制中应用-基因编辑

 

研究背景：在印戒癌 (SRCC) 中常见 E-钙粘蛋白的表达缺失，CDH1 基因编码 E-钙粘蛋白，是钙依赖性细胞粘附蛋白，属于钙粘蛋白家族成员，CDH1 基因参与调节细胞粘附、迁移和上皮细胞增殖，其功能缺失导致细胞更容易侵袭与转移，该基因的突变与胃癌密切相关。因此，E-钙粘蛋白表达的缺失可能会增加患胃癌的概率。
 

2022 年 6 月，日本科研团队在 Gastric Cancer 上发表了 Potential therapeutic targets discovery by transcriptome analysis of an in vitro human gastric signet ring carcinoma model，利用基本编辑技术，敲出了正常胃癌类器官的 CDH1 基本，，构建了 E-钙粘蛋白的胃癌类器官模型。

 

通过 RNA-seq 测序，研究发现敲除后的肿瘤类器官与 SRCC 的细胞形态和细胞活力类似，同时还发现，CDH 1 KO hGO 细胞中 matrix metalloproteinase (MMP）基因上调，MMP 为水解细胞外基质蛋白质的酶类，包括基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶等。然后科学家们对 95 例临床胃癌组织样本进行免疫荧光验证，结果显示，MMP-3 的确在临床样本中高表达。此外发现，CXCR4 从细胞核易位细胞膜上，加入 CXCR4 的配体 CXCL12 后，基因敲除的类器官生长期变长，在临床 SRCC 患者中纤维细胞分泌高表达 CXCL12。从而得出结论 MMP 和 CXCL12/CXCR4 有望成为 E -cadherin 缺陷性 SRCC 的新治疗靶点。

 

3. 单细胞测序中类器官技术应用

 

单细胞测序技术也是近年来受到青睐的明星技术，分别在 2018 年和 2019 年被 Science 期刊评为年度十大技术，被 Nature methods 评为年度方法。高通量单细胞测序技术通过对每个细胞遗传物质的分析，在单细胞分辨率下研究细胞的发育、分化，成为探索组织发育、肿瘤异质性等生物问题的重要方法。单细胞转录组测序与类器官结合，pubmed 关键词搜索已经达到 251 篇，类器官技术极大推动了器官发育、肿瘤研究、药物筛选、临床研究等多个领域的发展。
 

2021 年 11 月，德国科学家团队在 nature communication 上发表了 Single-cell analysis of patient-derived PDAC organoids reveals cell state heterogeneityand a conserved，文章构建了 18 个原发性胰腺导管腺癌和 6 个胰腺导管腺癌肝转移肿瘤类器官，通过 10X genomic 单细胞转录组测序比较分析肿瘤类器官和原发性 PDAC，鉴定共有细胞亚群，包括循环祖细胞和分化的分泌细胞亚群。「classical」细胞亚群为胰腺导管腺癌分化发育的最终形态。在基于活体成像的药物筛选实验中，发现「classical」亚群细胞基因表达，则对药物反应敏感。

 

PDAC 离体肿瘤样本很难获取，且恶性细胞含量较低。通过建立 PDAC 单细胞转录图谱，显示与原组织相似，证明了 PDAC 类器官可作为肿瘤异质性体外研究的临床相关模型，可为患者临床治疗预后判断提供依据。

 

类器官的未来发展
 

1. 类器官未来发展方向-血管生成

目前大多类器官本身并不具备血管化的结构。随着类器官体积的增长，类器官受限于氧气的缺失以及代谢废物的增加，可能导致的组织坏死。已有研究构建血管内皮细胞微环境的肿瘤类器官，将类器官肿瘤细胞和血管内皮细胞在 Matrigel 上共同培养，生成血管结构以期解决类器官血管化缺失的问题。

2. 类器官未来发展方向-共培养

2019 年 Nature Protocol 期刊发表了肿瘤类器官和免疫细胞共同培养的相关 protocol，可以体现和模拟出肿瘤微环境的部分特征。以上皮类器官和免疫细胞共培养模型为例，可通过在培养基中添加活化的免疫细胞、在组织消化成单细胞后和免疫细胞共同生长、添加 ECM 中的重组细胞因子等方法重塑类器官和免疫细胞的相互作用。
 

3. 类器官未来发展方向-标准化

 

标准的形成，是在中国干细胞标准委员会及陈晔光院士的支持和推动下，由陈晔光院士团队联合国内几十家单位制定。编者联合学术界、产业界专家对肠癌类器官的培养，鉴定和质控等一系列过程进行了探讨，经过大量数据研究及充分研讨，最终形成国内人肠癌类器官标准，为类器官技术的临床研究和临床实践提供了规范和指导。
 

该标准规定了人肠癌类器官及人肠道类器官的定义、伦理要求、技术要求和检测方法，为患者来源的人肠癌类器官的制备和检测提供了技术支持。该标准的制定获得了类器官及标准领域中外专家广泛的关注与高度评价。