- 移动端
爱必信(上海)生物科技有限公司品牌商
14 年
手机商铺
- NaN
- 0
- 0
- 2
- 2
推荐产品
公司新闻/正文
如何高效从细胞培养上清中获取高质量外泌体用于多维度下游分析？
39 人阅读发布时间：2026-06-09 13:28
外泌体（Exosomes）是由细胞分泌的小型膜性囊泡（直径30-150 nm），内含RNA、蛋白质及脂质等生物活性分子，广泛存在于血液、唾液、尿液及乳汁等体液中。作为细胞间通讯的重要载体，外泌体通过传递其内含的效应分子或信号分子，在免疫调节、肿瘤转移、组织修复等生理病理过程中发挥关键作用。然而，传统超速离心法提取外泌体存在步骤繁琐、硬件门槛高、操作难度大的局限，而基于聚合物沉淀原理的专用试剂盒为细胞培养上清样本的外泌体提取提供了更高效的解决方案。
图：外泌体生物发生与结构特征
为什么传统超速离心不再是细胞上清外泌体提取的最优解？
传统差速超速离心法被视为外泌体分离的"金标准"，但其固有缺陷在细胞培养上清处理中尤为突出：
技术瓶颈：
- 设备依赖
- 时间成本
- 回收效率
- 操作复杂性
相比之下，基于聚合物沉淀法的提取试剂盒通过改变溶液中分子的溶解度特性，使外泌体在低离心力（10,000×g左右）条件下即可沉淀，显著降低了对超高速离心设备的依赖。
图：不同外泌体提取方法对比（差速离心vs超速离心）
细胞上清外泌体提取试剂盒的核心组分是什么？
标准试剂盒通常包含两种关键组分：
- 1. 外泌体浓缩溶液（Exosome Concentration Solution, ECS）
这是一种经过优化的聚合物缓冲体系，通过改变外泌体在水溶液中的溶解度，促使纳米级囊泡从水相中析出。该溶液无核酸酶污染，可直接用于后续RNA分析。
- 2. 外泌体纯化过滤器（Exosome Purification Filter, EPF）
用于去除杂质和浓缩外泌体颗粒，通过分子筛效应拦截外泌体同时允许小分子杂质透过，进一步提高外泌体纯度。
如何建立标准化的外泌体提取流程？
完整的提取流程分为三个阶段，严格遵循以下步骤可确保获得高纯度、完整的外泌体颗粒：
阶段一：样品预处理——去除干扰杂质
细胞培养上清样本的质量直接影响最终提取效果。建议起始样本量不低于20 mL，以确保足够的外泌体产量。
操作要点：
- 细胞碎片清除
- 大分子杂质去除
- 上清转移
图：外泌体提取流程示意图
阶段二：外泌体沉淀——关键孵育步骤
沉淀反应：
按一定比例（通常为4:1，即20 mL上清加入5 mL浓缩溶液）加入ECS试剂，通过涡旋震荡混匀1分钟，确保溶液充分混合。
静置孵育：
将混合液置于4°C冰箱静置8小时以上（不超过24小时）。此步骤是外泌体充分聚集沉淀的关键，延长静置时间可提高得率，但过长可能导致非特异性蛋白共沉淀。
离心收集：
4°C条件下10,000×g离心60分钟，弃去上清后保留管底沉淀（富含外泌体颗粒）。再次短暂离心（10,000×g，2分钟），尽可能吸尽残留上清液。
阶段三：纯化与重悬——获得即用级外泌体
重悬处理：
使用适量1×PBS缓冲液（建议每20 mL原始上清使用200 μL PBS）吹打重悬沉淀物。操作需轻柔，避免剧烈震荡导致外泌体破裂。
纯化过滤：
将重悬液转移至纯化过滤器（EPF柱）中，4°C条件下3,000×g离心10分钟。收集柱管底部液体，即为纯化后的外泌体悬液。
保存建议：
将纯化后的外泌体按实验需求分装，保存于-80°C超低温冰箱，避免反复冻融影响外泌体完整性。
提取后的外泌体可用于哪些下游实验？
通过上述流程获得的外泌体具有完整的膜结构和生物活性，适用于多种分析平台：
1. 形态与粒径表征
- 透射电镜（TEM）：观察经典双凹圆盘状或杯状结构
- 纳米颗粒追踪分析（NTA）：测定粒径分布（30-150 nm）和浓度
2. 分子成分分析
- 核酸分析：RT-qPCR、RNA-seq、芯片检测
- 蛋白质组学：Western Blot、质谱分析
3. 功能学研究
- 细胞学实验：细胞增殖、迁移、分化、凋亡检测
- 动物实验：体内靶向分布、代谢动力学、治疗效应
4. 生物标志物发现
- RNA/蛋白表达谱分析
- 疾病诊断/预后标志物筛选
操作中需要注意哪些关键细节？
Q1：细胞上清样本如何正确采集与保存？
新鲜收集的细胞培养上清应立即置于冰上，若不能立即处理，可短期保存于4°C（不超过24小时），长期保存需-80°C冻存。冻存样本解冻时应在25°C水浴中快速解冻，完全融化后立即置于冰上，避免反复冻融。
Q2：为何需要去除细胞碎片和杂质？
残留的细胞碎片和蛋白杂质会与外泌体共沉淀，干扰后续电镜观察和蛋白分析。充分的预处理可显著提高外泌体纯度，减少非特异性背景。
Q3：离心转速如何准确换算？
不同离心机的转子半径不同，需根据RCF（×g）值而非RPM（转速）来设置离心机。公式为：RCF = 1.118 × 10^-5 × r × (rpm)^2，其中r为有效离心半径（单位：cm）。
Q4：提取过程中如何避免外泌体损失？
- 转移上清时避免吸到沉淀
- 重悬沉淀时使用适当体积的PBS，避免过度稀释或浓缩
- 使用无核酸酶、无菌的PBS缓冲液，避免外泌体内容物降解
Q5：如何评估提取外泌体的质量？
建议通过"金标准"三重验证：
- 形态学：电镜下观察杯状结构
- 粒径分析：NTA显示主峰在30-150 nm范围
- 蛋白标志物：Western Blot检测CD63、CD9等阳性标志物和Calnexin等阴性标志物（应缺失）
通过标准化的操作流程和严格的质量控制，细胞上清外泌体提取试剂盒能够为研究者提供足够产量和纯度的外泌体样本，支撑从基础生物学机制到临床转化应用的多层次研究需求。
爱必信细胞上清外泌体提取试剂盒推荐
Absin产品线：
爆款产品：十大试剂盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、生化检测、残留检测、多因子检测)；细胞培养(类器官试剂盒+基质胶，胎牛血清+培养添加剂+细胞因子)、分化试剂盒；分子(mRNA合成服务+提取试剂盒)；化合物大包装；辅助试剂、耗材/仪器、定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
特色产品：鸡胚提取物CEE、B27、N2、霍乱毒素B亚单位CTB、牛脑垂体提取物BPE、百日咳毒素PTX、重组人胰岛素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
|
爱必信(上海)生物科技有限公司 联系邮箱：info@absin.cn 微信公众号：爱必信生物 |
 |