帕金森病“运动+非运动”双效小鼠模型构建方案

帕金森病（PD）是一种常见于中老年人群的慢性、进行性神经系统退行性疾病，其核心病理特征为黑质致密带多巴胺能神经元的选择性进行性丢失，导致纹状体多巴胺神经递质水平显著降低。该病在临床上主要表现为运动症状（如静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势平衡障碍）和非运动症状两大类。近年来，非运动症状如疼痛、抑郁、焦虑、认知功能障碍等日益受到关注，因其发生率高（疼痛和抑郁的发生率可达40%-85%），且严重影响患者的生活质量，但目前的治疗手段尚不能有效缓解这些症状。建立能够同时模拟PD运动与非运动症状的稳定动物模型，对于深入揭示PD的发病机制及开发新的治疗策略具有重要意义。

本方案基于 6-羟基多巴胺（6-OHDA）单侧损毁纹状体构建PD小鼠模型，可稳定诱导模型小鼠出现痛敏反应及抑郁样行为等非运动症状，同时可伴随经典运动功能障碍，适用于 PD 非运动症状的发病机制研究、潜在治疗靶点筛选等相关实验，实验对象为 C57BL/6 小鼠，整体操作包含实验准备、动物建模、行为学检测、统计学分析四大核心环节，具体操作如下。

一、实验核心准备

（一）实验动物选择与饲养

动物品系：7 周龄 SPF 级雄性 C57BL/6 小鼠，体质量(22±2)g，无特定病原体感染，雌雄选择为雄性以减少生理周期对实验结果的干扰。

饲养环境：恒温恒湿环境，采用 12h 光 / 暗循环光照模式，食物和水自由摄取；小鼠购入后先适应饲养 1 周，再开展后续建模操作，减少环境应激对实验的影响。

动物分组：随机分为对照组（注射生理盐水）和模型组（注射 6-OHDA），参考实验分组为对照组 8 只、模型组 7 只，可根据实验需求适当调整样本量，保证组间均衡。

（二）主要试剂与仪器

核心试剂：2.5g/L 6-OHDA（abs42070403）、生理盐水、地昔帕明、红霉素软膏

地昔帕明用于术前腹腔注射，抑制外周单胺氧化酶，减少 6-OHDA 在外周的降解，提高建模效率。

关键仪器：立体定位框架、注射泵、Von Frey 纤维丝、行为分析系统（SMART V3.0）、异氟烷麻醉机、加热垫、钻孔器、高速摄像机，以及用于机械痛、悬尾、强迫游泳实验的专用测试箱 / 容器。

二、6-OHDA 诱导 PD 小鼠模型构建（单侧纹状体注射法）

（一）术前预处理

建模手术前 30min，对小鼠进行腹腔注射地昔帕明，剂量为 25mg/kg，注射后将小鼠置于安静环境，等待麻醉操作。

（二）麻醉与固定

采用异氟烷对小鼠进行吸入麻醉，待小鼠进入麻醉状态后，将其固定于立体定位框架上，术中持续给予异氟烷维持麻醉深度，避免小鼠苏醒。

手术过程中，将小鼠放置于加热垫上，维持其体温稳定；同时将红霉素软膏涂抹于小鼠眼部，防止长时间光照造成眼损伤。

（三）手术操作（左侧纹状体定位与注射）

术区准备：剃除小鼠头部手术部位毛发，用无菌剪刀做切口，充分暴露前后囟，为脑区定位做准备。

脑区定位：以小鼠前囟为原点，进行前后、左右调平，确定左侧纹状体坐标：内侧 / 外侧（M/L）：-1.8mm；前 / 后（A/P）：+0.4mm；背 / 腹（D/V）：-3.5mm。

钻孔与注射：用钻孔器在定位点处钻孔，将连接注射泵的微量注射器置入左侧纹状体区，分别向对照组、模型组注射 2μL 生理盐水、2.5g/L 6-OHDA（abs42070403），注射流量控制为 0.5nL/s，保证试剂缓慢、均匀注入。

术后处理：注射完成后，停针 10min，防止试剂回流，随后缓慢退出注射器；对手术切口进行无菌处理，将小鼠放回饲养笼，待其自然苏醒，术后持续观察小鼠精神状态、进食饮水情况，确保其正常存活。

（四）建模后恢复期

建模手术完成后，将小鼠放回标准饲养环境，进行 2 周的恢复期饲养，期间保证环境安静，减少外界刺激，待 2 周后开展行为学检测，验证模型构建效果。

三、模型有效性验证（行为学检测）

建模后 2 周，依次进行机械痛实验、悬尾实验、强迫游泳实验，分别检测小鼠痛敏反应和抑郁样行为，所有实验操作前，均将小鼠置于实验环境适应 30min，减少环境应激对行为学结果的干扰。

（一）机械痛实验（Von Frey 纤维丝法）

实验装置：放置有金属网格的专用测试箱，不同强度的 Von Frey 纤维丝。

操作方法：将小鼠置于测试箱中，从 1g 强度开始，采用 Up-down 法，用纤维丝垂直刺激小鼠左后爪中部，刺激程度以纤维丝弯曲成 S 形为准，每次持续刺激 5s，每只小鼠共刺激 5 次。

结果判定：计算小鼠50% 后爪回撤阈值，模型组小鼠该阈值显著低于对照组（t=6.854，P<0.001），表明模型小鼠出现痛敏反应，建模后痛觉过敏特征显著。

（二）悬尾实验（检测抑郁样行为）

实验装置：离地 30cm 的悬尾装置，行为分析系统（SMART V3.0），高速摄像机。

操作方法：将小鼠尾巴固定于悬尾装置，使小鼠呈尾巴朝上、头部朝下的倒立姿势，用摄像机和行为分析系统记录 6min 小鼠行为。

结果判定：统计小鼠不动时间百分比，小鼠出现持续不动状态判定为 “行为绝望状态”，模型组小鼠不动时间百分比显著高于对照组（t=3.828，P<0.05），表明模型小鼠出现抑郁样行为。

（三）强迫游泳实验（验证抑郁样行为）

实验装置：高 30cm 的透明容器，行为分析系统（SMART V3.0），高速摄像机，水温控制装置。

操作方法：向透明容器内加入℃的水，将小鼠放入容器中，用摄像机和行为分析系统记录 6min 小鼠行为，当小鼠持续不动超过 2s 时，记录其不动时间。

结果判定：计算小鼠6min 内不动时间百分比，模型组小鼠该指标显著高于对照组（t=2.958，P<0.05），进一步验证模型小鼠存在抑郁样行为。

四、实验数据统计与分析

分析软件：采用 GraphPad Prism 6 软件进行统计学分析，保证数据分析的准确性和专业性。

数据表示：所有计量资料以xˉ±s（均数 ± 标准差）形式表示，直观反映数据的集中趋势和离散程度。

检验方法：对照组与模型组间均数比较采用独立样本 t 检验，以P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.001为差异具有极显著统计学意义。

模型判定标准：若模型组小鼠 50% 后爪回撤阈值显著降低，且悬尾、强迫游泳实验中不动时间百分比均显著升高，即表明 6-OHDA 单侧纹状体注射诱导的 PD 小鼠模型构建成功。

五、实验注意事项与关键要点

6-OHDA 使用：6-OHDA 为儿茶酚胺类神经毒素，操作时需做好防护；试剂现配现用，避免放置时间过长导致药效降低，注射剂量精准控制为 5μg（2μL×2.5g/L），该低剂量可稳定诱导非运动症状，减少小鼠死亡率。

立体定位精度：纹状体定位的坐标精准性是建模成功的关键，操作时需严格按照 M/L：-1.8mm、A/P：+0.4mm、D/V：-3.5mm 定位，避免脑区偏差导致建模失败。

行为学实验一致性：所有行为学实验需由同一实验人员在同一时间、同一环境下完成，减少人为和环境因素对实验结果的干扰；实验过程中保持环境安静，避免外界刺激影响小鼠行为。

动物福利与存活：术后密切观察小鼠状态，及时处理术后感染等问题；行为学实验后，将小鼠放回饲养笼，给予充足的食物和水，符合动物实验伦理要求。

六、模型应用与延伸

模型特征：本模型通过单侧纹状体注射低剂量 6-OHDA，可稳定诱导小鼠出现机械痛敏反应和抑郁样行为，同时可伴随 PD 经典运动功能障碍，贴合临床 PD 患者除运动症状外，常合并疼痛、抑郁等非运动症状的病理特征。

适用研究：适用于 PD 疼痛、抑郁等非运动症状的神经机制研究，以及针对 PD 非运动症状的药物、基因、物理治疗等潜在治疗靶点的筛选和验证。

实验延伸：可在本模型基础上，增加认知功能、焦虑样行为等其他非运动症状的检测，或结合分子生物学实验，探究纹状体、海马、黑质等脑区的神经递质（多巴胺、5 - 羟色胺）、炎性因子、信号通路（PI3K/Akt/mTOR）等与 PD 非运动症状的关联。

参考文献：

[1] Haider, Achi et al. “Translational molecular imaging and drug development in Parkinson's disease.” Molecular neurodegeneration vol. 18,1 11. 10 Feb. 2023, doi:10.1186/s13024-023-00600-z
[2] Bonito-Oliva, Alessandra et al. “A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions.” Frontiers in behavioral neuroscience vol. 8 290. 27 Aug. 2014, doi:10.3389/fnbeh.2014.00290
[3] Zhang, Jia-Qi et al. “Dysfunction of subthalamic dopaminergic circuitry contributes to anxiety- and depression-like behaviors in 6-OHDA lesion-induced hemiparkinsonian mice.” Acta pharmacologica Sinica vol. 46,10 (2025): 2622-2636. doi:10.1038/s41401-025-01570-2
[4] 史雅颖,张静,谢俊霞,等.6-OHDA诱导帕金森病模型小鼠的疼痛及抑郁样行为[J].青岛大学学报(医学版), 2025, 61(3):368-370.

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