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多重免疫组化VS免疫荧光
3969 人阅读发布时间：2020-12-15 13:41
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique，IF ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
多重免疫组化（mIHC）：主要的技术原理来自TSA技术，TSA即酪酰胺信号放大(Tyramide signal amplification)是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该技术可与高性能染料Alexa Fluor®、传统荧光染料和比色检测系统相兼容。 TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的Streptavidin—HRP/荧光基团结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子or荧光基团，结果使其检测信号得到几何级放大。
mIHC和IP的区别：
| 多重免疫组化(mIHC) | 免疫荧光(IP) | |
| 靶点数量 | 可同时染色7色（含dapi） | 一般标记三种(含dapi)大于三种效果差 |
| 一抗种类 | 同一种属的不同抗体即可满足要求 | 不同种属的不同抗体 |
| 二抗 种类 | 不同种属的不同抗体 | 连接荧光探针的不同种属二抗 |
| 染色策略 | 分步染色，多次重复进行免疫组化操作 | 样本抗原的空间位置的差异，需要设计复杂的染色策略。样本/靶点的差异导致染色策略的差异，染色过程复杂、多变 |
| 染色效果 | 高染色分辨率和染色特异性，信号强度更强,更稳定,淬灭时间更长，无背景影响，各靶点的信噪比大大提高，尤其适合组织基于单细胞的定量分析 | 亮度较弱,容易淬灭,各种抗体间存在互相影响，背景较高，对基于单细胞的定量分析不利。 |
| 实验成本 | 1同一种属的一抗和二抗，价格相对便宜。 2简单的染色策略和无需任何重复的预实验，即可掌握整个染色技术，大大缩小了预实验的材料损耗。 3一抗和二抗工作浓度更低,单次费用更低 |
1不同种属的抗体价格存在差异，一般种属稀少的价格高。 2不同种属的二抗，价格存在差异，一般稀少的种属价格高。 3寻找合适的染色策略，复杂的多次重复的预实验大大的增加了实验成本 |
| 应用范围 | 二抗具备通用性，因此实验室中所有的研究领域均可使用 | 二抗不具备通用性，实验室中应用领域受到局限 |
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