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Western Blot进阶技巧第一弹——从了解目的蛋白开始

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Western Blot进阶技巧第一弹——从了解目的蛋白开始

1966 人阅读发布时间：2020-05-26 14:22

蛋白质印迹 (Western Blot)，相信大家对此都不陌生，做为检测蛋白表达及半定量的基础实验方法，也是很多小伙伴们初入实验室的第一门课。

“上手容易，精通难”可谓对WB实验的最佳注释，初入实验室的“菜鸟”可以很快上手，做出漂亮的条带，做过多年的“大神”也可能一着不慎，实验“翻车”，结果一塌糊涂。有些实验室甚至流传着一些所谓的“玄学”，新手人品好，难做的条带给新手做等等。

真的是这样么？实验技术可不是拼人品，靠运气的事儿，接下来小编将会为大家带来WB进阶技巧系列，干货满满，让大家提升WB实验技巧，成为真正的实验“大神”。

首先，让我们了解一下什么是WB实验吧：

▲《定义》WB又称为免疫印迹 (immune blot) ，是根据抗原抗体的特异性结合半定量的检测样品中的某种蛋白的方法。

▲《原理》通过凝胶电泳，将不同分子量大小的蛋白质分离开，再利用特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

▲《应用》定性检测：目标蛋白有无，分子量大小；定量检测：检测目标蛋白含量（半定量）
新闻图片1

图1. WB操作流程图

看到这，相信之前对WB了解不多的同学也应该对WB有了一个基础的认识。那么，怎样可以把这看似简单的几步做好，拿到漂亮的实验结果呢？话不多说，上干货。

小编首先要强调的一点，就是了解目的蛋白，这也是今天这篇文章主要给大家分享的内容。可能有的小伙伴会有疑问，为什么要讲一个跟WB操作没关系的步骤呢？说好的WB进阶呢？其实，这往往是很多新手忽视的关键点，对目的蛋白一知半解，是没有办法做好WB实验的，其他免疫学实验也是一样，可能有的小伙伴还不是特别相信，接下来让小编带大家看看为什么了解目的蛋白是如此的重要吧~

了解目的蛋白对整个WB实验的重要性：

1. 了解目的蛋白，才知道目的蛋白在实验样品中是否有表达

WB实验检测，很多小伙伴会遇到的问题之一就是无条带，也就是阴性结果，如何判断阴性结果是实验操作问题造成的“假阴性”还是本该如此的“真阴性”，这就需要大家在实验前，就对目的蛋白有一个清晰的认识。很多蛋白的表达是有组织特异性的，例如IL-10R，在视网膜，脾脏和肺腺癌组织中有高表达，其他组织表达含量较低；还有一些蛋白，则需要特定的刺激条件才会高表达，这种情况往往在磷酸化蛋白及炎症因子蛋白等中较为常见，如果未做特殊的处理，目的蛋白表达含量很低，无法被WB检测出。

2.了解目的蛋白，才知道如何制备样本

样本制备也是WB的关键步骤，后续的文章中也会为大家详细分析。如何选择合适的样本制备方法，关键因素就是要了解目的蛋白；除了上面第一步中的要了解目的蛋白表达组织，及预处理条件外，还需确认目的蛋白表达的亚细胞定位，例如，细胞膜蛋白，核蛋白，线粒体蛋白和胞浆蛋白的提取方式都不一样，选择合适的方式，才能制备合格的样品，方便后续的WB实验。另外一个需要注意的因素就是需要加入对应的蛋白酶抑制剂，这一点对于磷酸化的蛋白尤为重要，否则蛋白在提取过程中就被降解，会造成“假阴性”结果。

图2. 裂解液选择参考表

3. 了解目的蛋白，才知道如何选择内参

内参抗体，是WB实验中的重要参考，WB可以对目的蛋白进行半定量分析，判断不同样品中目的蛋白表达含量的多少，就是取决于内参的标定。内参选择在WB实验中是很关键的因素，可不是GAPDH或者β-actin万用的哦。内参如何选择，最重要的决定因素就是目的蛋白，尤其是目的蛋白的表达位置及预处理条件。小编在这里总结了一下内参的选择表，大家可以保存哦~

图3. 内参选择参考表

好了，相信大家应该知道实验前了解目的蛋白的重要性了吧，如何了解目的蛋白呢？可以通过UniProt网站搜寻蛋白的相关信息，也可以在Pubmed上查阅对应的研究文献，相信聪明的小伙伴们肯定可以做好的，今天的分享就先到这，接下来我们还会分享整个WB操作过程中的细节，全面提升大家的WB水平，欢迎关注！

蛋白质印迹（Western Blot）实验中产品推荐：

实验步骤	推荐指数	货号	产品名称	规格
样本制备		abs9228	RIPA (中)	100ml
		abs9229	RIPA (强)	100ml
		abs9230	RIPA (弱)	100ml
		abs9231	RIPA (强，无抑制剂)	100ml
		abs9160	NP-40	100ml
		abs9195	1M Tris-HCl，pH6.8	1L
		abs9201	1M Tris-HCl，pH8.8（更多pH请看官网）	1L
		abs9117	SDS	100ml
	★★	abs9116	WB/IP 细胞裂解液	100ml
	★★	abs9239	WB/IP 细胞裂解液(无抑制剂)	100ml
	★★★★	abs9101	红细胞裂解液	100ml,250ml,500ml
		abs812852	PMSF	50mg,100mg,200mg
		abs816442	Aprotinin 抑肽酶	10mg,25mg,50mg,100mg
		abs817902	Peptatin 胃蛋白酶抑制剂A	10mg,25mg,50mg,100mg
		abs9133	EDTA	100ml
		abs42017684	EGTA	1g,10g
		abs817431	原钒酸盐	100mg,500mg
		abs47014865	β-甘油磷酸盐	10g,25g
	★★	abs9161	广谱型蛋白酶抑制剂混合物	1ml
	★★	abs9162	广谱型磷酸酶抑制剂混合物	1ml
蛋白定量	★★	abs9232	BCA蛋白定量试剂盒	500次,2500次
蛋白定量	★★	abs9233	增强型BCA 蛋白定量试剂盒	500次
上样与电泳		abs9226	DTT溶液(1mol/L)	5ml,10ml
		abs9237	2X Laemmli样品缓冲液	5ml*2
		abs9238	10%SDS十二烷基硫酸钠溶液	500ml
	★★	abs953	2*上样缓冲液 (适用于SDS-PAGE)	10ml
	★★	abs9301	预制胶 10%,10 wells	5片/盒
	★★	abs9308	预制胶 10%,15 wells	5片/盒
	★★	abs9302	预制胶 12%,10 wells	5片/盒
	★★	abs9309	预制胶 12%,15 wells	5片/盒
		abs9303	预制胶 15% ,10 wells	5片/盒
		abs9310	预制胶 15% ,15 wells	5片/盒
		abs9304	预制胶 4-15%, 10 wells	5片/盒
		abs9311	预制胶 4-15%, 15 wells	5片/盒
	★★	abs9305	预制胶 4-20%, 10 wells	5片/盒
	★★	abs9312	预制胶 4-20%, 15 wells	5片/盒
		abs9307	预制胶 8%, 15 wells	5片/盒
		abs9306	预制胶 8-20%, 10 wells	5片/盒
		abs9313	预制胶 8-20%, 15 wells	5片/盒
	NEW	abs9328	3-5kd小分子量预制胶，16.5%，10wells	10片/盒
	NEW	abs9329	3-5kd小分子量预制胶，16.5%，15wells	10片/盒
	★★★	abs925	蛋白电泳套装	盒
		abs951	running buffer	100ml,1L
	★★★★★	abs923	预染蛋白marker, 10-245 KDa	500ul,5*500ul
	★★★★★	abs924	预染蛋白marker, 10-180 kDa	250ul,2*250ul
		abs966	Genshare考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液	500ml
	★★★	abs964	考马斯亮蓝染色试剂盒(常规型)R250	1kit
		abs965	考马斯亮蓝染色试剂盒(增强型)G250	1kit
转膜		abs931	PVDF膜0.2 μm	20张
	★★	abs932	PVDF膜0.45 μm	20张
	★★	abs959	NC膜0.2 μm	20张
		abs960	NC膜0.45 μm	20张
		abs950	10*电转液	100ml,1L
封闭		abs9174	脱脂奶粉	100g,500g
封闭	★★★★★	abs9155	BSA	50g,100g
一抗孵育	★★	abs830031	Beta actin antibody	50ul,100ul
		abs132001	Beta actin antibody	50ug,100ug
		abs119680	Beta Actin Polyclonal Antibody	50ul,100ul
		abs132184	Beta-Actin antibody	50ug,100ug
		abs137975	Beta-Actin Mouse Monoclonal Antibody	50ug,100ug
	★★	abs830030	GAPDH antibody	50ul,100ul
		abs132004	GAPDH antibody	50ug,100ug
		abs137959	GAPDH Mouse Monoclonal Antibody	50ug,100ug
		abs118936	GAPDH Polyclonal Antibody	50ul,100ul
		abs131993	Tubulin alpha Antibody	50ug,100ug
	★★	abs830032	Tubulin Beta antibody	50ul,100ul
		abs131994	Tubulin beta Antibody	50ug,100ug
		abs125209	Tubulin Beta Polyclonal Antibody	50ul,100ul
二抗孵育	★★	abs928	Goat anti-mouse IgG-HRP	100ul,500ul,1ml
	★★	abs20002	Goat anti-rabbit IgG-HRP	100ul,500ul,1ml
	★★	abs20003	Goat anti-Mouse IgG-FITC	1ml,500ul,100ul
	★★	abs20004	Goat anti-Rabbit IgG-FITC	100ul,500ul,1ml
	★★	abs20005	Rabbit anti-Goat IgG-HRP	100ul,500ul,1ml
一抗孵育		abs830001	Anti- GST	50ul,100ul
		abs830002	Anti- His Tag抗体	50ul,100ul
		abs830003	Anti- His(C-terminal Specific) 抗体	50ul,100ul
		abs830004	Anti- Myc 抗体	50ul,100ul
		abs830005	Anti- DYKDDDDK	50ul,100ul
		abs830006	Anti- HA 抗体	50ul,100ul
		abs830008	Anti-V5,mAb	50ul,100ul
		abs830010	Anti- GST,HRP	50ul
		abs830011	Anti- His Tag (HRP) 抗体	50ul
		abs830012	Anti- His(C-terminal Specific) (HRP) 抗体	50ul
		abs830013	Anti- Myc (HRP) 抗体	50ul
		abs830014	Anti- DYKDDDDK,HRP	50ul
		abs830015	Anti- HA (HRP) 抗体	50ul
		abs830016	Anti- V5 (HRP) 抗体	50ul
		abs137956	C-Myc-Tag Mouse Monoclonal Antibody	50ug,100ug
		abs137958	Flag-Tag Mouse Monoclonal Antibody	50ug,100ug
显色	★★★★★	abs920	ECL化学发光检测试剂盒	225ml,250ml,2*250ml
		abs9212	DAB 显色试剂盒（棕黄色，WB）	1kit
		abs9213	DAB 显色试剂盒（紫蓝色，WB）	1kit
其他辅助试剂		abs952	10*TBST	100ml,1L
		abs9152	Tween-20	500ml
	★★	abs954	WB专用一抗二抗稀释液	100ml
		abs969	Western一抗二抗去除液（中性）	250ml
		abs968	Western一抗二抗去除液（弱碱性）	250ml
		abs967	Western一抗二抗去除液（强碱性）	250ml
新手必备	★★★★★	abs926	WB solution base kit（rabbit）	1kit
	★★★★★	abs927	WB solution base kit（mouse）	1kit
	★★★★★	abs928	WB solution base kit（goat）	1kit

Absin特色产品线：
WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

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蛋白印迹（Western Blot）实验中的内参

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