动物造模专题：EAE造模无症状？这些细节您必须知道

动物模型，是医学研究者精心构建的模拟人类疾病表现的生命载体，其精准复刻了疾病的复杂进程与关键特征。主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学（包括新药筛选）研究。比如一些经典的动物模型———EAE模型、糖尿病模型、肠炎模型、帕金森模型、AD模型等。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是 MS 最常见的动物模型，具有许多临床和病理生理学特征。EAE模型多种多样，反映了人类 MS 的不同临床、免疫学和组织学特征。通过主动诱导的 EAE 小鼠模型是最容易诱导且结果稳健、可复制的模型。它特别适合使用转基因小鼠研究药物或特定基因对自身免疫性神经炎症的影响。因此，小鼠通过皮下注射中枢神经系统匀浆或髓鞘蛋白肽进行免疫。

由于这些肽的免疫原性较低，因此使用了强效佐剂。EAE 的易感性和表型取决于所选抗原和啮齿动物品系。C57BL/6 小鼠是转基因小鼠构建中最常用的品系，且对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）有反应。将免疫原性表位 MOG35-55 悬浮在完全弗氏佐剂（CFA）中进行免疫，并在免疫当天及两天后注射百日咳毒素。小鼠在免疫后 9-14 天内出现“经典”自限性单相 EAE，表现为上升性弛缓性瘫痪。小鼠每天使用临床评分系统进行评估，持续 25-50 天。

EAE模型诱导的成功率受多种因素的影响，包括小鼠的种类和性别、百日咳毒素的剂量、佐剂的使用、乳化程度以及丰富的实验基础和建模经验。今天小爱着重为大家讲解EAE造模过程中需要注意的细节。

一、EAE造模方法

1、实验动物：6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠

2、动物适应：将动物在实验环境中适应1周，保持温度、湿度和光照条件稳定，并使它们能够自由获取食物和水。

3、EAE模型建立

（1）MOG(35-55)溶液配制：将 MOG(35-55)（abs815889）多肽粉末充分溶解于预冷（4℃）无菌 PBS，终浓度为2.0 mg/mL。
注意：多肽溶解后常温下易变性，长时间储存容易失效，并且会有冻融稳定性风险，建议现配现用。

（2）弗氏完全佐剂（CFA）溶液配制：将热灭活结核杆菌 H37 Ra 悬浮于CFA（abs9270）或弗氏不完全佐剂（abs9271）中，并通过充分搅拌，热灭活结核杆菌的终浓度达到 8.0 mg/mL。
警告：热灭活的结核分枝杆菌刺激先天免疫反应，避免吸入、摄入以及与皮肤和眼睛接触。制备佐剂时严格避免针刺伤，因为它可能导致肉芽肿或诱发自身免疫反应。

※热灭活的结核分枝杆菌的作用及使用浓度

① 增强免疫原性

提供“危险信号”：结核杆菌的细胞壁成分（如分枝杆菌酸、脂阿拉伯甘露聚糖等）可通过Toll样受体（TLR2/4）激活固有免疫系统，促进抗原提呈细胞（APC）的成熟和炎症因子（如IL-12、TNF-α）的释放，从而增强对MOG35-55的免疫应答。
诱导Th1/Th17极化：结核杆菌成分可驱动CD4+ T细胞向促炎的Th1（分泌IFN-γ）和Th17（分泌IL-17）亚群分化，这是EAE发病的核心机制。

② 形成肉芽肿反应

结核杆菌的持续刺激可导致注射部位形成肉芽肿，延长抗原释放时间，维持慢性炎症状态。

③ 终浓度范围：4–10 mg/mL，过高浓度（>10mg/mL）可能导致过度炎症或动物死亡。

④ 爱必信的CFA（abs9270）每毫升含 1mg 热灭活的干燥结核分枝杆菌 (H37Ra, ATCC 25177)。

（3）抗原乳液制备：按照 1:1 体积比将MOG(35-55)多肽溶液和 CFA 溶液加入两支 10mL 玻璃注射器中，并通过三通连接两支注射器。在冰上反复推注40min-2h，将抗原乳化至油包水状态，MOG(35-55)多肽浓度达到 1.0mg/mL。

注意：①肽段的纯度必须>98%；

②在制作乳液的过程中，损失量是很大的（一般损失1/3—1/2）。理论上一只小鼠需注射MOG肽200ug，十只鼠2mg，但加上损失量，免疫十只鼠需称取4mg，以防损失后不够用。乳液剩余，可放入4度冰箱，一星期之内使用没问题；

③乳液制备不能使用塑料注射器，避免有机溶剂干扰，防止蛋白质吸附；

④乳剂可在免疫前储存数天。制备乳剂后至少等待30分钟以观察其是否稳定，溶液应呈白色、粘稠且无相分离。免疫前，将溶液抽入两个注射器中的一个，并连接针头。

（4）PTX 溶液的制备：将50μg百日咳毒素（abs42024900）在500μL ddH2O（双蒸水）中复溶，得到100 μg/mL的储备液，储存于4 °C。取 PTX储备液加入无菌 PBS（abs962） 中稀释，终浓度达到 3.0 ng/μL；
警告： 百日咳毒素具有多种生物学效应。避免吸入、摄入以及与皮肤和眼睛接触。

（5）麻醉小鼠：使用异氟烷麻醉小鼠；

（6）EAE 模型：首先对麻醉后小鼠剃毛，在背部皮下、腋窝和腹股沟各皮下注射 50.0 μL 由 CFA 乳化的MOG(35-55)多肽溶液（确保皮下形成一个球状肿块，该肿块应在整个实验过程中持续存在）。在MOG(35-55)多肽乳液注射当天和 48 h 后，通过腹腔注射300ng/只的 PTX以增强疾病诱导（在小鼠尾根部进行颜色标记，确保可以轻松识别个体小鼠以进行每日评估）。

二、EAE模型监测

（1）临床评分及体重监测

应每日评估体重和临床评分。EAE的发作通常与体重减轻相关，每日监测并记录 EAE 小鼠临床表现及体重变化。

① 标准化评分系统0-5分量表（最常用）：从第0天开始，连续观察30天或更长时间。 评分标准：0分：无症状。1分：尾部无力或瘫痪。2分：后肢无力。3分：后肢瘫痪。4分：四肢瘫痪。5分：死亡。

② 体重监测：EAE小鼠通常伴随体重下降（>10%提示模型成功），需每日记录，体重持续下降可能需伦理干预。

注意：当小鼠出现 EAE 临床症状时，重要的是确保水瓶仍然可以被触及，并将食物放在笼子地板上。

图1 具有EAE症状的免疫小鼠图片

图2 典型疾病进程(n=6)

（2）行为学检测

① 运动功能评估

转棒实验（Rotarod）：加速模式（4-40 rpm，5min内完成）记录跌落时间，反映协调性与耐力。

步态分析（CatWalk或足印法）：量化步幅长度、基宽、摆动速度。

② 抑郁样行为检测

强迫游泳实验（FST）：记录不动时间（反映绝望行为）。

悬尾实验（TST）：辅助验证抑郁表型。

（3）组织病理学验证

① 取材与处理

灌注固定：4%多聚甲醛灌注后取脊髓（腰膨大段）和脑组织。

切片制备：石蜡切片（5μm）或冷冻切片（10μm）。

② 染色方法

（4）分子生物学验证

① 流式细胞术

细胞亚群分析：Th1（CD4+IFN-γ+）、Th17（CD4+IL-17+）、Treg（CD4+FoxP3+）。

样本来源：脾脏、淋巴结、中枢神经系统单细胞悬液。

② 细胞因子检测

ELISA/液相芯片：促炎因子：TNF-α、IL-6、IL-17

抗炎因子：IL-10、TGF-β

qPCR：脊髓/脑组织中细胞因子mRNA表达。

③ 蛋白表达分析

Western Blot：

炎症通路蛋白：NF-κB p65、pSTAT3

神经保护标志物：BDNF、NGF

三、模型成功标准

基础标准：发病率>80%（临床评分≥2）；病理确认HE显示炎性浸润+ LFB证实髓鞘脱失。

高级标准：行为学异常（Rotarod时间↓50%）；分子标志物：Th17比例↑2倍，CNS中IL-17水平显著升高。

四、EAE造模无症状原因分析

五、EAE动物模型特色应用案例

1. PTX构建C57BL/6小鼠EAE模型，成功揭示了SPAK信号通过调控脉络丛屏障驱动MS病理的核心作用，并为SPAK-NKCC1抑制剂（如ZT-1a、布美他尼）治疗MS提供了临床前证据。

引用文献：J Neuroinflammation. 2025 Mar 13;22:80. IF:9.3

2. PTX构建SD大鼠EAE 模型，研究Roflumilast在调节神经炎症，改善多发性硬化症(MS)运动功能和抑郁症状中的作用。

引用文献：J Affect Disord. 2024 Apr 1:350:761-773. IF:6.6

参考文献:

[1] Qi C, Wang Y, Li X, et al. Target inhibition of SPAK in choroid plexus attenuates T cell infiltration and demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 2025;22(1):80.

[2] Wang Z, Zhang Y, Chai J, et al. Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor function and depressive symptoms in multiple sclerosis. J Affect Disord. 2024;350:761-773.

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