荧光探针是潜在的荧光团，可根据生物微环境变化、与被分析物相互作用或特定化学反应显示荧光信号。由于其具有操作简单、选择性好、灵敏度高、检测范围广、响应速度快以及对样品损伤小等优点，已经被成功应用于生物医学、生命科学及环境科学等领域。

 

钙离子荧光探针：

 

钙（Calcium）是一种重要的且普遍存在的第二信使，参与调控各种各样的细胞过程，包括细胞增殖、基因转录、肌肉收缩和胞吞作用。响应于大量的刺激物，钙离子（Ca2⁺）从胞内的储存池释放出来，而胞内Ca2⁺浓度的增加会引起细胞功能的活化、调节和终止。许多泵和离子通道都允许这种独特的阳离子进入和离开细胞，并且在细胞质和胞内蓄池间移动。

图 CaSR（钙感应受体）在高葡萄糖处理的心脏成纤维细胞激活中的作用示意图^[1]

 

Fluo 3-AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，Fluo-3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525～530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。Fluo 4-AM是Ca²⁺荧光探针Fluo 3-AM的改良版本。

Fluo 4-AM相比较于Fluo 3-AM的优势：

1）激发和发射波长往短波长偏移10nm，更接近氩激光器的波长，因此，当使用488nm进行荧光激发，得到更强的荧光信号，比Fluo-3强一倍；
2）50μg小包装供应，使用方便，且能很好保证产品的稳定性。

图 用Fluo 3-AM对胞浆Ca²⁺进行染色，并通过检测荧光强度进行评估^[1]

 

活性氧（ROS）探针：

 

活性氧类物质（Activated oxygen species，AOS），又称反应性氧类物质（Reactive oxygen species，ROS），体内的各种生理和病理过程都能生成。ROS的生理效应通过与大量易氧化的胞内物质反应来发挥，这些物质包括NADH、NADPH、抗坏血酸、组胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋白质和核酸。ROS还能氧化胆固醇和不饱和脂肪酸，引起膜脂质氧化。

 

2′,7′-二氯二氢代荧光黄二醋酸（2′,7′-Dichlorofluorescin Diacetate, DCFH-DA），是一种通用的氧化应激指示剂。可渗透细胞膜，本身无荧光。一旦进入细胞后，被细胞酯酶水解生成2′,7′-二氯二氢荧光素（DCDHF）并进一步被氧化生成强荧光的2′,7′-二氯荧光素（DHF）。DCFH-DA与细胞内氧化应激产生的多种活性氧都有反应，包括过氧化氢（H₂O₂）、过氧基（ROO•）和过氧亚硝基阴离子（ONOO^-）。DCFH-DA常用来监测细胞氧化还原过程。二氢罗丹明123（DHR123）是DCDHF的类似物，具有亲脂性，通过细胞膜扩散。存在活性氧物质的情况下，细胞内的二氢罗丹明123氧化为荧光R123，定位在线粒体中。

图 DCFH-DA探针监测癌细胞内活性氧的产生^[2]

 

硫化氢（H₂S）荧光探针：

 

硫化氢（H₂S）是继一氧化碳和一氧化氮之后，第三种可在生命体内发挥生理作用的内源性气体信号分子。该气体分子在心血管和神经系统中担负着重要的生理病理调节作用。在生物检测技术手段中，荧光探针法具有选择性好、灵敏度高、对生物样品损伤小以及可实现实时原位检测等独特的优势，故应用荧光探针法检测细胞内H₂S浓度的变化是近年来研究热点之一。

 

WSP-1（Washing State Probe-1）是一种含活性二硫化物的荧光探针，用来检测生物样本和细胞内的H₂S。通过基于反应的荧光开启策略，WSP-1选择性且快速与H₂S反应，生成苯丙二硫醇酮（benzodithiolone）和一种荧光化合物（见图1）。WSP-5（Washing State Probe-5）也是一种H₂S荧光探针，WSP-5与WSP-1相比，其靶向H₂S表现出更快的荧光开启速率和更灵敏的检测限。

图 WSP-1检测H₂S反应机制^[3]

 

应用实例：

图 用WSP-1对植物细胞进行内源性H₂S的示踪和荧光成像检测^[4]

图 用WSP-5对SHSY5Y和U87MG细胞进行H₂S荧光显微镜成像检测^[5]

 

荧光探针不仅可以检测阳离子和阴离子，还可以检测活性氧及硫化氢等小分子化合物。近年来检测生物酶和细菌等生物活性物质的荧光探针也越来越多。最值得一提的是，由于部分荧光探针具有良好的生物相容性、高灵敏度、无创性、稳定的发射特性和实时成像等优点，使得基于荧光探针的生物成像技术发展迅速，现在已成为可视化多种生理和病理过程的有力工具。

 

 

参考文献

 

[1] Yuan H , Fan Y , Wang Y , et al. Calcium-sensing receptor promotes high glucose-induced myocardial fibrosis via upregulation of the TGF-beta(1)/Smads pathway in cardiac fibroblasts[J]. Nature reviews neuroscience,2019(2):20.
[2] Chen W J, Yang M Y, Li J, et al.GSH-Activatable Metal-Phenolic Networks for Photothermal-Enhanced Chemotherapy and Chemodynamic Therapy[J]. FunctionalBiomaterials.,2023, 14(9), 436.
[3] Liu C ,  Pan J ,  Li S , et al. Capture and Visualization of Hydrogen Sulfide by a Fluorescent Probe[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50(44).
[4] Li Y J ,  Chen J ,  Xian M , et al. In Site Bioimaging of Hydrogen Sulfide Uncovers Its Pivotal Role in Regulating Nitric Oxide-Induced Lateral Root Formation[J]. Plos One, 2014, 9(6):e90340.
[5] Jurkowska H , Wróbel, Maria, Szlęzak D , et al. New aspects of antiproliferative activity of 4-hydroxybenzyl isothiocyanate, a natural H₂S-donor[J]. Amino Acids, 2018.

 

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