“你好，我的样本是养的细胞，我还能做多色组化吗？”

答案是可以！对于多重荧光免疫组化（mIHC）来说，几乎不挑剔样本类型，但需要攻克一个难题——多轮洗脱。传统的组织样本经过前期处理固定包埋，再加上防脱载玻片的助力，在洗脱过程中，脱片概率相对小，即使有小部分脱落，但影响不至于很大；而细胞样本，有可能在一张片子上，本身细胞数量就不多，如果还有脱落，可能最后“颗粒无收”。今天Absin分享的是细胞样本做多色的方法，其中不可或缺的依旧是我们的“老演员”——抗体洗脱液（abs994）。

 

一、建议操作步骤：

 

1）样本准备：制备细胞样本（细胞爬片、细胞涂片等），建议直接使用腔室载玻片进行细胞培养，方便后续检测。完成制备后，用PBS简单漂洗（2×2min）；
2）细胞固定：用4%多聚甲醛常温固定10-20min，PBS洗涤3×5min；
3）淬灭内源性过氧化物酶：滴加3% H₂O₂，室温下孵育10-30min，PBS洗涤3×5min；
4）细胞通透（胞膜指标省略此步）：滴加含1-0.25% Triton X-100的PBS溶液，室温下处理10min，PBS洗涤3×5min；
5）封闭：滴加封闭液（5%二抗同来源封闭血清或BSA），室温孵育30min；
6）一抗孵育：弃封闭液，滴加稀释好的一抗工作液，于避光湿盒内4°C孵育过夜或37℃ 1-2h（湿盒中可加少量水，防止抗体孵育过程干片），PBS漂洗3×5min；
7）二抗孵育：滴加与一抗相应种属的HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育20-50min，PBS漂洗3×5min；
8）染料孵育：滴加现配的1*TSA染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），反应1-10min，PBS漂洗3×5min；
9）抗体洗脱：抗体洗脱液37℃预热，甩去PBS后，滴加洗脱液浸润整个爬片，洗脱时间可控制在15-30min（洗脱难度：结构性膜蛋白和细胞骨架蛋白＞胞浆蛋白＞胞核蛋白），PBS漂洗3×5min；
10）重复进行步骤[5→9]，直到完成所有指标染色；
11）滴加1*DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min，PBS漂洗3×5min；
12）滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡；
13）扫描成像，数据分析。

 

二、注意事项：

 

1）若某些抗体难以洗脱，建议降低一抗稀释比例，或将该靶点排到最后一轮进行染色；
2）抗体洗脱液在使用时要根据实际情况调整孵育时间和洗脱温度，若时间太长有可能损伤抗原靶点以及细胞核形态；
3）若既有膜指标又有胞内指标，可先做膜指标，再做胞内指标，在进行胞内指标染色之前再进行打孔，若一开始就打孔，可能影响胞膜指标的染色；
4）由于细胞样本可能存在的脱片问题，可在开始多色实验之前先模拟多次抗体洗脱的过程，多次使用抗体洗脱液洗脱与PBS漂洗，观察细胞脱落情况，若明场不便观察，可染一下DAPI再观察；
5）上述操作步骤并不一定适合所有样本和抗体，需要根据实际情况调整实验细节。

 

货号	产品名称	规格	货期
abs50012	四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔二抗）	20T	现货
abs50028	四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（兔二抗）	20T	现货
abs50013	五色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔二抗）	20T	现货
abs50029	五色多重荧光免疫组化染色试剂盒（兔二抗）	20T	现货
abs50014	六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔二抗）	20T	现货
abs50030	六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（兔二抗）	20T	现货
abs50037	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒plus（鼠兔二抗）	20T	现货
abs50038	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒plus（兔二抗）	20T	现货
abs994	抗体洗脱液（mIHC专用）	30ml	现货

 

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