间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的多能成体干细胞，广泛存在于脐带、骨髓、脂肪、牙髓、月经血等组织，体外培养可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种类型的细胞。

图1 The Mesengenic Process（图片来源于文献，仅供学习参考用）

 

MSCs具有自我更新能力和多向分化潜能，能够释放出许多具有抗凋亡、免疫调节、促血管生成等功能的生物活性因子，可刺激组织器官再生，并且低水平表达主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子，不表达MHC-Ⅱ类分子，不易激活T细胞的免疫反应，具有低免疫原性。这些特点和功能使MSCs成为细胞治疗的首选，美国临床信息公示数据库显示，截止今年9月份，共有1583项MSCs的临床实验，研究主要集中于心血管疾病、新冠肺炎、骨关节损伤、自身免疫性疾病等。

图2 MSCs研究者分布和MSCs研究热点

 

随着MSCs的研究如火如荼，不同的分离方法、营养体系随之而来，如何评判不同分离方法的MSCs获得率成为了一个难题，为了解决这个问题，2006年，国际细胞治疗学会的间充质和组织干细胞委员会提出了定义人类MSCs的最低标准。

 

1、MSCs在标准培养条件下必须具有塑料粘附性

 

MSCs具有异质性，不同物种，不同组织来源大小有所差异，例如猫脂肪来源MSCs脐带来源MSCs小，所以无法单一的从外观判定MSCs，但是几乎所有的MSCs都是贴壁生长，具有较强的贴壁能力，多数MSCs呈纤维细胞样生长，呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出突起。传代后细胞呈旋涡状排列生长。

图3 人骨髓间充质干细胞（图片来源于网络，仅供学习参考用）

 

2、特异性表面抗原（Ag）的表达

 

通过流式细胞术测量，95%的MSCs群体必须表达CD105、CD73和CD90。此外，这些细胞必须缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA II类的表达（5/2%阳性）。

 

表1 MSCs特异性表面抗原的表达指标

Phenotype	Positive (≥95%)	Negative (≤ 2%)
	CD105	CD45
	CD73	CD34
	CD90	CD14或CD11b
		CD79a或CD19
		HLA II

 

3、在体外具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力

 

三系分化能力是MSCs最独特的鉴定MSCs的方法，向成骨细胞的分化可以通过用茜素红染色或von Kossa染色来证明，向脂肪细胞分化最容易通过油红O染色来证明，成软骨细胞分化通过阿利辛蓝或免疫组织化学染色来证明。

图4 人MSCs成骨分化诱导 abs9453

图5 人MSCs成脂分化诱导 abs9454

图6 人MSCs成软骨分化诱导 abs9455

 

三系分化小问答：

 

1、如何解决成骨分化后细胞极易脱壁的现象？
1）试剂盒内含有包被液，可在铺板前使用；
2）分化时细胞汇合度不易过高，请按照说明书指示；
3）多孔样品换液时应尽量分批迅速，避免细胞表面干涸，加液时手法轻柔，不能直接冲击皿底，换液时培养基必须复温；
4）诱导过程中更换培养液时不要清洗，诱导结束后清洗时一定要轻柔，避免剧烈晃动。

2、成脂分化时细胞形态变差？
1）成脂时细胞汇合度一定要达到90%左右；
2）若用完全诱导培养基B时发现细胞状态变差，可以根据具体情况提前更换为完全诱导培养基C；
3）诱导过程中无需清洗，诱导结束后清洗时一定要轻柔，避免剧烈晃动。

3、成软骨诱导后软骨球不悬浮或者软骨球碎裂？
1）细胞成软骨诱导离心时，推荐220g离心5min，具体情况可以调整，以细胞聚团为准，离心力过大软骨球不易悬浮，过小软骨球表面易分散；
2）诱导后24 小时内避免摇动细胞沉淀，以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管；
3）注意开关培养箱门时动作要轻柔，不要震动。

4、软骨球是否可以做冰冻切片？
可以，做冰冻切片时固定后可以用蔗糖梯度脱水，若不及时切片染色，需用铝箔纸包裹，保存在-80℃。

 

MSCs鉴定相关的讲解就到这里啦，老师们有细胞培养相关问题可以添加下方交流群一起探讨。

 

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参考文献

 

[1] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement[J]. Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-317.

[2] Caplan A I, Correa D. The MSC: an injury drugstore[J]. Cell stem cell, 2011, 9(1): 11-15.

 

 

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