质粒小科普

 

质粒(Plasmid)是广泛存在于生物界中的环状双链DNA分子。目前在细菌、放线菌、真菌和不少动植物细胞中均发现有质粒的存在，其中细菌质粒是研究最深入、应用最广泛的^[1]。因为质粒分子本身具有复制功能的遗传结构，可携带一些遗传信息，并且其自我复制能力和携带遗传信息能力非常强大，经过基因表达后可使其宿主细胞表现相应的性状，所以质粒常被用作基因载体，在分子生物学、生物化学与细胞生物学等学科中得到广泛的应用^[2]。

图1 大肠杆菌质粒分子结构示意图

 

质粒提取方法及原理

 

质粒的提取是分子克隆中常用的一种技术，即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒的过程。质粒的质量直接影响到基因操作的后续步骤，如转化、酶切和序列分析等，因此获得足够量的质粒是质粒应用的重要一步。生物学实验中质粒的获取方式主要是通过在大肠杆菌中扩增，从而获取大量的含有目的基因的载体质粒。其主要过程是对感受态细菌进行转化，挑取克隆菌落，在LB培养基中摇菌进行扩增和质粒抽提^[3]。科研工作者已经开发出很多质粒抽提的方法，目前普遍采用的质粒提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法和有机溶剂法等。碱裂解法提取质粒具有得率高，适用面广、快速、纯度高等特点，因此碱裂解法目前被广泛采用。下面着重介绍碱裂解法提取质粒的原理。

图2 质粒提取过程

 

碱裂解法提取质粒主要原理是利用共价闭合环状质粒和线性染色质在拓扑学上的差异。利用NaOH和SDS溶液使细胞裂解，在碱性溶液中，线性的大分子量细菌染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离。当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，它们之间交联形成不溶性网状结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结合沉淀下来。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA小分子量的RNA留在上清液中，混杂的RNA用RNaseA除去。一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。由于碱裂解法的众多优势，市面上大多数的质粒抽提试剂盒基本采用的方法是碱裂解法。

 

质粒提取分类

大多数实验室都会选择基于碱裂解法的质粒提取试剂盒来提取质粒，根据不同的样本量及获取目标质粒的产量分为质粒小提、质粒中提、质粒大提。

 

1、质粒小提

质粒小提主要是对于1-5mL的菌液中质粒DNA进行小量提取，获得的质粒用来进行常规的载体构建实验。

 

Absin金牌产品：无内毒素高纯度质粒小量快速提取试剂盒（abs60023）

1、采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过过滤柱除去内毒素； 
2、离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
3、独有的去蛋白液配方，可以高效去除核酸酶。即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
4、独特内毒素清除方法，清除内毒素效果一般小于<0.1EU/μg。

 

Absin质粒小提产品清单：

货号	产品名称	规格
abs60023	无内毒素高纯度质粒小量快速提取试剂盒	50T
abs60024	无内毒素高纯度质粒大量快速提取试剂盒	10T
abs60295	小量质粒提取试剂盒	100T
abs60296	小量高纯去内毒素质粒提取试剂盒	100T

 

2、质粒中提

质粒中提是在质粒小提的基础上进一步去除菌液中的内毒素，获得的质粒可以用于细胞转染，常规需要菌液量为10-15mL。

 

3、质粒大提

质粒大提与中提方法相同，一次可对100-200mL菌液进行抽提，从而获得大量质粒。

 

Absin金牌产品：去内毒素中大量质粒富集提取试剂盒（abs60300）

1、高效提取中大量菌液质粒DNA，提取菌液量：5mL、10mL、20mL、50mL、100mL或以上；
2、提取质粒DNA纯度高，可高效去除质粒中污染的内毒素，内毒素去除率可高达90%以上，有效提升质粒转染实验的成功率；
3、真空浓缩，大幅提升洗脱液中质粒DNA浓度，DNA浓度可达2ug/uL以上；
4、用于培养菌液样本中质粒DNA的提取，提取后的质粒DNA可用于细胞转染、酶切、PCR、测序、体外转录与翻译、构建文库等多种分子生物学实验。

 

Absin质粒中提、大提产品清单：

货号	产品名称	规格
abs60297	中大量高纯质粒提取试剂盒	40T
abs60298	中大量高纯质粒富集提取试剂盒	60T
abs60299	去内毒素中大量质粒提取试剂盒	40T
abs60300	去内毒素中大量质粒富集提取试剂盒	60T

 

质粒提取其实并不难，但是选择符合我们实验的质粒提取方法和试剂盒非常重要，因为又快又好地提取出符合下游实验要求的质粒，无疑会对我们的实验起到锦上添花的作用。

本期的分子小课堂就到这里啦，祝大家实验顺利，我们下期再见啦！

 

 

参考文献

 

[1] Lars Mølbak, Tett A, Ussery D W, et al. The plasmid genome database.[J]. Microbiology, 2003, 149(Pt 11):3043-5. DOI:10.1099/mic.0.C0123-0.

[2] Diaz Ricci J C ,Hernández ME. Plasmid Effects on Escherichia coli Metabolism[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2000, 20(2):79-108. DOI:10.1080/07388550008984167.

[3] Li G , Liu J , Chen N, et al. A new method to recover L-tyrosine from E. coli fermentation broth A new method to recover L-tyrosine from E. coli fermentation broth[J].Bioengineered, 2020, 11(1):1080-1083.DOI:10.1080/21655979.2020.1827893.

 

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