一、免疫荧光的原理

 

免疫荧光(Immunofluorescence，IF)技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

 

二、IF分类

 

中文全称	缩写	中文全程	实验样本
细胞免疫荧光	IF-IC	细胞免疫荧光	悬浮或贴壁细胞
组织免疫荧光	IF-F	冰冻切片免疫荧光	冰冻组织，抗原保存更加，但要避免出现冰晶
	IF-P	石蜡切片免疫荧光	石蜡包埋的细胞团或组织，易储存，形态佳

 

三、IF实验流程

 

1）样品准备：对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤 (1000rpm、5min) 2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片；

2）固定：4%多聚甲醛(PFA)溶液固定细胞15min，PBS洗涤3遍，每次5min；

3）通透：0.5% TritonX100，通透15-20min，PBS洗涤3遍，每次5min；

4）封闭：3%牛血清蛋白(BSA)室温封闭30min-1h ，封闭的作用是可以减少一抗和二抗与非靶标位点进行非特异性结合时所产生的本底信号；

5）抗孵育：封闭过后，不用洗，直接将多余的BSA吸走，用稀释后的一抗（用3% BSA稀释）4度过夜孵育;

6）二抗孵育：PBST洗涤3遍，每次5min，洗去未结合的抗体。而后用稀释后的二抗（用3% BSA稀释）室温避光孵育1h，PBST洗涤3遍，每次5min；

7）细胞核染色：滴加DAPI避光染色5min，PBS洗涤3遍，每次5min（染细胞核是为了定位细胞）；

8）拍照：立即用激光共聚焦或荧光显微镜进行拍照，如果需要等待，则避光放在4°保存。

 

四、检测方法

 

检测方法分为直接检验和间接检验，我们一般多采用间接检验（一抗+二抗）的方式。

 

抗原检测	荧光素偶联一抗	荧光素偶联二抗	二抗处联HRP，酪氨信号放大系统
优点	操作简便，一步法，多染信号强度中等时不受抗体来源限制	信号强度中等	信号强，多染时不受抗体来源限制
缺点	信号强度低	两步法，背景可能变高	需要摸索条件，可能带来背景或非特异染色

 

五、免疫荧光双染

 

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色双重免应焚光标记法也分为直接法和间接法。

1）直接法：将两种不同荧光素偶联的抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，样本孵育，润洗，封片，镜检；

特点：简便可靠，不需要考虑一抗种属来源的问题，但灵敏度较低。

2）间接法：用未标记的两种一抗薄育样本，润洗后，加入两种不同的荧光素偶联的对应二抗辩育样本，润洗，封片，镜检；

3）特点：使用此法应注意两种特异性一抗必须来源于不同种属，且荧光标记二抗、一抗的种属要相匹配。

 

六、IF注意事项

 

1）固定时间影响荧光固定效果，针对细胞样品，如果用4%多聚甲醛固定，推荐固定时长15min，时间太短没有达到固定效果时间太长会导致甲醛被氧化成甲酸，没有固定作用了；

2）保持醛固定液新鲜，否则自发荧光背景会升高；

3）使用抗体时，需要查询说明书。因为不同抗体使用场景不一样，确认抗体是否能用于细胞IF、冰冻切片IF、 石蜡切片IF；

4）细胞密度是整个实验能否成功的关键点之一。如果细胞数量太多，产生叠加，也会影响整体荧光效果；

5）洗涤过程轻柔，防止加液过程冲力过大丢失细胞；

6）通透时间一般为15-20min，过短过长效果均不好，应做不同时间梯度摸索。

 

七、IF常见问题总结

 

1）信号微弱或没有信号

可能原因	解决方法
目的蛋白需要诱导表达或者表达量低	对于需要诱导表达的蛋白，参考文献找到诱导蛋白表达的最佳处理条件和阳性对照；表达量低的蛋白考虑信号扩增，或与更亮的荧光基团配对；在可能的情况下，应使用蛋白印迹法或其他方法来确认蛋白表达情况
样本保存不当。如荧光基团在光线下 暴露时间过长，可能会导致信号衰减	在避光条件下进行孵育和保存样本。可在防淬灭的溶液中封固样本。样本封固后要立即采集图像，以获取最佳结果
细胞/组织样本保存时间过长	使用新制备的样本载玻片/板
固定不足	请参考产品说明书；处理后立即移除介质并在固定剂中快速、彻底地清洗对于磷酸化特异的抗体，使用浓度为至少4%的甲醛来抑制内源性磷酸酶
抗体用量不合适	参见说明书建议的抗体稀释浓度，并根据样本表达量进行摸索
一抗孵育时间不合适	建议在4”C过夜孵育以获得最佳结果
错误的通透方法	参见产品说明书中建议的提作步骤
二抗使用不当	按建议浓度使用，检查二抗是否与一抗的宿主物种相匹配
错误的激发波长	确保激发和检测(激光/激发/发射滤光器)与荧光基团激发光波长相匹配

 

2）高背景

原因	解决方法
封闭不充分	使用与二抗相同物种的正常血清，封闭1h
抗体使用浓度过高	参考说明书推荐浓度，并根据蛋白表达量进行优化
抗体育时间过长或孵育温度过高	参考说明书推荐的孵育时间和温度
样本变干	染色过程中，确保样本始终彻底漫没在液体中
清洗不足	清洗以移除多余固定剂、多余二抗，以及结合松散、非特异性的抗体相互作用
样本自发荧光	以未染色样本为对照，检测自发荧光程度。参考说明书推荐的固定剂，用久了的固定剂可能会出现自发荧光。更换陈旧甲醛、制备新鲜的稀释液。使用在安瓶中新稀释的、可用于电子显微镜（EM级）的戊二醛。为低丰度靶标选择较长的波长通道
非特异性抗体结合	如可能，请与敲低(siRNA)或除细胞，或与已知靶抗原表达水平较高或较低的细胞进行比较

 

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