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鼠尾胶原—细胞的松软“席梦思”
235 人阅读发布时间:2023-04-13 13:21
胶原蛋白是结缔组织和内脏器官细胞外基质的主要构造成分,在皮肤、肌腱、骨骼中分布最为广泛。从遗传和结构上胶原蛋白分为许多类型。
胶原蛋白I(Collagen, Type I)是由2个α1 链和1个α2 链组成的异源多聚体(图1),在37℃,中性pH 下自发形成三螺旋骨架,是一种优秀的细胞培养用基质,广泛用于肝细胞、成纤维细胞、脊神经节、肌肉细胞、施万细胞、胚肺细胞、上皮细胞和其他大量细胞系。还能用于研究细胞生长、分化、迁移以及发育过程中的组织形态发生。
图1 胶原蛋白I分子模型
鼠尾胶原蛋白I 是根据Birkedal-Hansen 方法,通过醋酸抽提、氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤制备。可用于包被细胞培养器皿,培养细胞表面粘附性,特别适合那些在普通培养器皿表面不易贴壁的细胞,比如成纤维细胞、肝细胞等原代细胞。还可用于三维胶的制备,模拟真实的生长环境,使得细胞在三维环境中生长。
本品为溶于6mM HAc 的无菌溶液(图2),浓度5mg/ml,每个批次产品皆通过细胞培养测试(包括三维空间培养)以保证质量的可靠性。接下来我们了解鼠尾胶原蛋白I的两种用途吧。
图2 鼠尾胶原蛋白I (abs47014921)
组织培养器皿的表面包被推荐浓度为1-5μg/cm2,起始浓度可首选5μg/cm2。建议根据具体细胞类型来优化。
本品以溶于6mM HAc(=0.36g/L HAc)的无菌溶液形式提供,本身不溶于中性pH,建议用6mM HAc溶液做进一步稀释。配制方法:取34.5μl 冰醋酸(17.4M)加入100ml双蒸水,充分混匀后即得到6mM HAc溶液,0.22μm滤膜过滤除菌后待用。
1)根据自身实验体系以及优化后的包被浓度来计算所需的胶原蛋白量,并加入相应孔内,确保胶原蛋白溶液完全覆盖表面。
a. 以包被浓度为 5μg/cm2,先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白(5mg/ml)稀释到合适的中间浓度,如50μg/ml, 然后参考表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内;
b. 以包被浓度为 2μg/cm2,先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白(5mg/ml)稀释到合适的中间浓度,如12μg/ml,然后参考表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内;
表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表
培养器皿 |
表面积(cm2,每孔或每皿) |
当包被浓度:2ug/cm2,中间稀释浓度12ug/ml,加入该稀释液体积(ul) |
当包被浓度:5ug/cm2,中间稀释浓度50ug/ml,加入该稀释液体积(ul) |
96孔细胞培养板 |
0.3 |
50 |
30 |
24孔细胞培养板 |
1.9 |
300 |
190 |
12孔细胞培养板 |
3.8 |
600 |
380 |
6孔细胞培养板 |
9.5 |
1580 |
950 |
35mm细胞培养皿 |
8 |
1330 |
800 |
60mm细胞培养皿 |
21 |
3500 |
2100 |
100mm细胞培养皿 |
55 |
9170 |
5500 |
2)室温孵育1h,小心吸掉多余液体,用无菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后,在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下,包被好的器皿在4-25°C至少可保存3个月。
当鼠尾胶原蛋白I使用浓度>1mg/ml,pH 7.0左右皆可形成具有一定强度的三维胶,建议成胶浓度为1-2 mg/ml。
由于本品是以溶于6mM HAc的无菌溶液形式提供,在成胶过程需先加入0.06倍体积的0.1M NaOH中和。
10×细胞培养液(依据培养的细胞种类而定)、0.1M NaOH、无菌水(abs9259)
1)取200μl胶原蛋白(5mg/ml)加到置于冰浴的离心管内,加入690μl无菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH【注:该步骤不能反,如果反过来把12μl 0.1M NaOH加到胶原溶液中,会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】,立即混匀。再加入100μl 10×细胞培养液,混匀后立即加到培养器皿中。【注:混匀后pH为7.0左右,如果培养液中没有加酚红,初次使用时需要用pH试纸测试】。
2)将培养器皿在室温(25°C左右)放置20min待胶凝固后,转移到培养箱内。
三维胶原制备(含细胞)(以配制1ml,1mg/ml三维胶为例):
a. 准备好细胞悬液,并放置于冰浴中。b,将200μl胶原蛋白(5mg/ml)加到12μl 0.1M NaOH【注:该步骤不能反,如果反过来把12μl 0.1M NaOH加到胶原溶液中,会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】,立即混匀。再加入23μl 10×细胞培养液,立即混匀【注:混匀后pH为7.0左右,如果培养液中没有加酚红,初次使用时需要用pH试纸测试】。再加入760μl 的细胞悬浮液,混匀后立即加到培养器皿中。
b. 将培养器皿在室温(25°C左右)放置20min待胶凝固后,加入适当体积细胞培养液,转移到培养箱中培养。
本期讲解就到这里了,如有细胞培养问题,欢迎扫码加入我们微信群交流。
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表2 小爱细胞培养类产品推荐
货号 |
品名 |
规格 |
胎牛血清(特级) |
500ml |
|
胎牛血清(优级) |
500ml |
|
胎牛血清(标准级) |
500ml |
|
高糖DMEM培养基 |
500ml |
|
RPMI-1640培养基 |
500ml |
Absin特色产品线:
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