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技术资料/正文
qPCR反应之你问我答
100 人阅读发布时间:2023-01-11 09:50
实时定量 PCR技术(real-time PCR)也叫 qPCR(Quantitave PCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。它是一项临床上非常成熟的技术,目前在分子生物学领域,qPCR核酸定量的首选方法。目前仍在全球肆虐的新型冠状病毒鉴定的“金标准”——核酸检测就是通过qPCR原理进行的。
图1 qPCR技术原理简图(图片来自henrik's lab)
那么拿到一个样本,需要经过以下多项操作流程才能定量检测到它的核酸含量。其中任何一个步骤操作失误都会导致它的检测结果出现异常,那让小爱来带您来看下出现常见问题的解答,为您解决qPCR实验中的痛点!
图2 qPCR实验操作流程图
FAQ:
1、无Ct值出现a) 检测荧光信号的步骤有误:一般染料法采用72℃延伸时采集,探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
b) 引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。
c) 模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
d) 模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
e) 反应循环数不够:一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环,但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2、Ct值出现过晚
a) 扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物。
b) 模板浓度太低:减少稀释度,重复实验。
c) 模板降解:重新制备模板,重复实验。
d) PCR产物太长:一般将PCR产物长度设计为100 bp-200 bp之间。
e) 反应体系中存在PCR反应抑制剂:一般为加入模板时带入,导致模板质量不高,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
3、阴性对照出现明显扩增
a) 反应体系组分(如水)被污染:实验过程中,更换新的Mix或者水重复实验。
b) 标本间的交叉污染或产物污染:反应体系在超净工作台内配制,对实验室进行严格的区分,减少气溶胶污染;使用带滤芯的枪头。
c) 引物二聚体的出现:引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
d) 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况,可配合熔解曲线进行分析。
4、熔解曲线出现多峰
a) 非特异性扩增。
b) 引物设计不佳:避免二聚体和发夹结构的出现。
c) 引物浓度不佳:适当调整引物浓度。
d) 退火温度低:提高退火温度。
e) 模板中有基因组DNA的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的污染(DNaseI处理),或通过设计引物避免非特异性扩增。
5、出现引物二聚体
a) 优化扩增条件,如提高退火温度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤)有利于强效扩增,因此引物设计时设定的成功退火温度为60°C。
b) 引物浓度太高,适当降低引物浓度。
c) 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带,通常位于100 bp以下。
6、扩增效率低
a) 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
b) 反应条件不佳:适当降低退火温度或改为三步扩增法。
c) 反应体系中有抑制物:一般为模板中引入,应先把模板适当稀释,再加入到体系中,减少抑制物的影响。
7、实验重复性差
a) 加样体积失准:使用性能较好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。
b) 定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。
c) 模板浓度太低:模板浓度越稀,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。
d) qPCR mix没有完全混匀,请使用前充分混匀。
除了实验操作的解答外,爱必信拥有全套qPCR解决方案来一站式帮您解决qPCR实验难题。
类别 |
货号 |
产品名称 |
规格 |
样本保存 |
RNA样品保存液 |
100mL |
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RNA保护因子 |
50T |
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RNA提取纯化 |
Trizol(总RNA抽提试剂) |
100mL |
|
组织/细胞RNA快速提取试剂盒(Dnase I) |
50T |
||
病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒 |
50T |
||
植物RNA快速提取试剂盒(DNase Ⅰ) |
50T |
||
全血RNA快速提取试剂盒(Dnase I) |
50T |
||
逆转录 |
Reverse Transcriptase |
10000U/10000U×5 |
|
Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge) |
50T/100T |
||
逆转录一管化三代预混液 |
100T |
||
qPCR |
一步法超级多重荧光定量PCR试剂盒(探针) |
100T/250T |
|
一步法超级荧光定量PCR试剂盒(探针) |
100T/250T | ||
Multiplex Probe One Step qRT-PCR Kit |
100T/500T |
||
SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix |
1mL×5/1mL×25 |
||
SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX Premixed) |
1 mL×5/1mL×25 |
||
SYBR qPCR SuperMix Plus(Low ROX Premixed) |
1 mL×5/1mL×25 |
||
抗体染料法定量PCR预混液(通用ROX) |
5×1mL |
||
染料法荧光定量PCR试剂盒(化学修饰) |
100T/200T/500T |
||
染料法荧光定量PCR试剂盒(抗体修饰) |
100T/200T/500T |
||
探针法荧光定量PCR试剂盒 |
100T/200T/500T |
||
UDG探针法荧光定量PCR试剂盒(防污染系统) |
100T/200T/500T |
||
超级多重荧光定量PCR试剂盒(探针) |
100T/200T/500T | ||
UDG多重探针法荧光定量PCR试剂盒(防污染系统) |
100T/200T/500T |